Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von Perfusionslösung und Testverbindungen
- Bereiten Sie 5 l Krebslösung vor: 113 mM Natriumchlorid, NaCl, 5,9 mM Kaliumchlorid, KCl, 1,2 mM Dihydrogen-Natriumphosphat, NaH2PO4, 1,2 mM Magnesiumsulfat, MgSO4, 25 mM Natriumbicarbonat, NaHCO3, 1,2 mM Calciumchlorid, CaCl2 und 11,5 mM Glukose. Tränken Sie die Lösung mit einem 95%igenO2 + 5%igen CO2 -Gasgemisch. ~500 ml sauerstoffhaltigen Krebs im Kühlschrank vorkühlen.
Bereiten Sie nach - Bedarf Aliquots von Stammtestverbindungen (1 mM Capsaicin in Ethanol und 10 mM 5-Hydroxytryptamin (5-HT) in Kochsalzlösung) vor. Verdünnen Sie das Material in Krebs (zur Badanwendung) und in Kochsalzlösung (zur intraluminalen Verabreichung) auf die Endkonzentration unmittelbar vor der Verwendung.
>2. Vorbereitung der Aufnahmeelektrode
- Ziehen Sie die Aufzeichnungselektrode mit einem herkömmlichen Elektrodenabzieher aus handelsüblichen Glasröhren ohne Innenfilamente (1,5 mm Außendurchmesser). Passen Sie die Abziehereinstellungen für Hitze und Zug so an, dass der Schaft der gezogenen Elektroden zwischen 20 und 25 mm liegt.
>3. Gewebeentnahme
- Betäuben Sie die Ratte gründlich mit Natrium-Pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
- Unter Gewährleistung der Sterilität legen Sie die Bauchhöhle frei, indem Sie mit einem Skalpell einen Mittellinienschnitt an der Bauchdecke durchführen. Ziehe das Mesenterium und andere Gewebe zur Seite, um das Kolorektum freizulegen.
- Legen Sie das Tier unter das Präpariermikroskop. Lokalisieren Sie durch vorsichtige Dissektion das linke Beckenganglion (PG) und identifizieren Sie die Beckennerven (PN) und die damit verbundenen lumbalen Splanchnikusnerven (LSN). Schneiden Sie diese Nerven einige Millimeter vom PG entfernt ab.
Anmerkung: Der PG liegt in der Nähe des kolorektalen Übergangs. Typischerweise 3 - 4 PN aus dem lumbosakralen Rückenmark und ein LSN-Projekt zum PG (Abbildung 1).
- Schneiden Sie den Symphysenknochen ab, um das Rektum freizulegen. Entfernen Sie das Gewebe (z. B. Harnblase usw.) über dem Darm. Achten Sie darauf, dass das PG intakt bleibt.
- Opfern Sie die Ratte durch die intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital. Durchschneiden Sie den Dickdarm etwa 3 cm oberhalb des PG und entfernen Sie den Darm mit einer Pinzette vom Tier.
- Den Darm in eine Petrischale geben, die mit vorgekühlter Krebslösung gefüllt ist. Entfernen Sie den Kot, indem Sie den Dickdarm vorsichtig spülen. Entfernen Sie die Reste der Harnblase und andere Gewebe vorsichtig, ohne das PG zu beeinträchtigen.
>4. Dissektion der zuvorkommenden Nervus colonus
- Legen Sie den Dickdarm in eine Aufnahmekammer (20 mL) und perfundieren Sie das Gewebe kontinuierlich mit karbogenierter Krebslösung. Stellen Sie die Perfusionsrate auf 15 mL/min ein.
- Kanülieren Sie das Kolorektum sowohl am oralen als auch am analen Ende. Beginnen Sie die intraluminale Infusion des Dickdarms mit Kochsalzlösung in einer Geschwindigkeit von 10 ml/h in oraler bis analer Richtung.
- Lokalisieren Sie den Haupt-PG unter dem Präpariermikroskop. Verwenden Sie Insektenstifte, um das Ganglion freizulegen. Bei sorgfältiger Sektion finden Sie einen feinen Ast des Nervs, der vom Ganglion ausgeht und in Richtung Dickdarm verläuft (Abbildung 1). Den Nerv in der Nähe des Ganglions durchtrennen.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine Aufzeichnung von einem Nervenast distal des PG. Der Nerv enthält vermutlich eine Mischung aus becken- und lumbalen afferenten Fasern. Alternativ kann eine Aufnahme von der PN und/oder der LSN proximal zum PG erfolgen.
- Schalten Sie das Heizbad ein und erwärmen Sie die Krebslösung, um die Kammertemperatur auf 34 ± 0,5 °C zu halten.
>5. Vorbereitung der Saugelektrode
- Nehmen Sie eine vorgezogene Glaspipette (Schritt 2) und untersuchen Sie sie unter dem Präpariermikroskop. Brechen Sie die Spitze der Elektrode mit einer Pinzette auf, so dass sie eine Größe hat, die mit dem Durchmesser des aufzunehmenden Nervs kompatibel ist.
- Schräge die Spitze ab, indem du sie in der Nähe eines helleren Flares platzierst.
>6. Elektrophysiologische Aufzeichnung
- Verbinden Sie die abgeschrägte Elektrode mit dem Elektrodenhalter. Schließen Sie eine 10-ml-Spritze an den seitlichen Anschluss an der Halterung an, um Unter- oder Überdruck auf die Elektrode auszuüben.
- Verbinden Sie die Halterung mit dem Kopftisch des Bioverstärkers und montieren Sie den Kopftisch auf einen Manipulator.
- Bewegen Sie die Elektrode in das Gewebebad und füllen Sie die Elektrode mit der Krebslösung, indem Sie sie leicht ansaugen, bis sie den Silberdraht des Halters berührt. Platzieren Sie die Elektrodenspitze in der Nähe des abgeschnittenen Endes des Nervs und üben Sie Unterdruck aus, um den Nerv in die Elektrode zu saugen. Üben Sie mehr Unterdruck aus, so dass ~1 mm des Nervs in die Elektrode gezogen wird und einen dichten Verschluss bildet.
- Schalten Sie den Bioverstärker ein und stellen Sie den Filter auf 300 - 3.000 Hz ein. Überwachen Sie das Signal auf dem Oszilloskop und zeichnen Sie das Nervensignal (20 kHz Abtastrate) und das intraluminale Drucksignal (100 Hz Abtastrate) mit einem Computer mit Spike-Datenverarbeitungssoftware auf.
>7. Testen der Sensitivität von Colon Afferent
- Wenden Sie eine Rampendehnung des Dickdarms an, indem Sie den Drei-Wege-Hahn an der Auslasskanüle schließen, während Sie kontinuierlich intraluminal infundieren. Überwachen Sie den intraluminalen Druck, bis er 60 mmHg erreicht, und öffnen Sie dann den Dreiwegehahn an der Drainagekanüle.
