Beurteilung der mitochondrialen Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen

Zusammenfassung

Quelle: Rellick, S. L. et al. Bewertung der bioenergetischen Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Beurteilung der mitochondrialen Funktion von zerebralen vaskulären endothelialen (CVE) Zellen mit Hilfe eines extrazellulären Flux-Assays. CVE-Zellen werden in einer extrazellulären Flussmittel-Zellkulturplatte plattiert. Extrazelluläre Flusssensoren werden hydratisiert, bevor sie in den Bioanalysator geladen und kalibriert werden. Die Platte mit den Zellen wird dann zur Analyse geladen.

Protokoll

>1. Saatgut und Behandlung von zerebralen vaskulären endothelialen (CVE) Zellen auf Zellkulturplatten

1. Aussaat von CVE-Zellen (bEnd.3-Zellen) auf einer extrazellulären 96-Well-Flux-Zellkulturplatte: 80 μl/Well. Stellen Sie die Zellkulturplatte bei 37 °C in einen 5 % CO₂ -Inkubator. Hinweis: 16 × 10³ Zellen pro Vertiefung erreichen innerhalb von 24 Stunden eine Konfluenz von 60 - 80 %.
2. Wenn die Zellen einer Chemikalie ausgesetzt sind, fügen Sie die Behandlungen hinzu, sobald die Zellen am Plattenboden befestigt sind (8 - 24 Stunden nach der Aussaat).
   Anmerkung: Bei Transfektionsexperimenten sollten Sie keine Antibiotika in ein vollständiges Wachstumsmedium geben.

>2. Beurteilung der mitochondrialen Funktion mit dem Bioanalyzer

1. Vor Beginn des Assays hydratisieren Sie eine extrazelluläre Flussmittelsensorkartusche mit Kalibrant, indem Sie 150 μl extrazelluläre Flussmittelkalibrantlösung auf die Platte geben und über Nacht bei 37 °C ohne CO₂ inkubieren.
2. Wechseln Sie das Zellkulturmedium mit der Plattenwaschstation in ein extrazelluläres Flussmittel mit einem pH 7,0. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C ohne CO₂ für 30 - 60 min.
3. Bereiten Sie Arbeitslösungen von 8 μM Oligomycin, 4,5 μM Carbonilcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), 10 μM Rotenon und 10 μM Antimycin A in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) vor. Laden Sie 25 μl der Stammlösungen in die Patroneninjektionsöffnungen: Anschluss A, Oligomycin; Anschluss B, FCCP; Port C, Rotenon und Antimycin A mit extrazellulärem Fluss-Assay-Medium. Implementieren Sie das Assay-Protokoll wie in Tabelle 1 beschrieben.
4. Legen Sie die hydratisierte Kartusche in den Bioanalysator und führen Sie die Kalibrierung durch, indem Sie auf die Schaltfläche "Start" klicken. Entfernen Sie nach Abschluss der Kalibrierung die Bodenplatte der Patrone und legen Sie die Zellenplatte ein, indem Sie auf die Eingabeaufforderung "Patrone entladen" klicken. Setzen Sie den Assay fort, bis alle Messungen abgeschlossen sind.
5. Öffnen Sie die Datendatei und beziehen Sie die Ratenwerte aus dem Bioanalysator. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei.

Tabelle 1. Das Instrument Run Protocol.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
bEnd.3 Zelllinie	ATCC	CRL-2299	25-30 Passagen
Dulbecco's Modifizierter Adler Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	Nr. S12450	10% im Endergebnis
Penicillin/Steptomycin	Hyklon	SV30010	1×100 Strumpf
0,25 % Trypsin 0,03 % EDTA-Lösung	Corning	25-053-CI
Natriumpyruvat	Corning	25-000-CI	1,0 μM im Finale
Traubenzucker	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM im Finale
Oligomycin	Sigma	Nr. O4876	1,0 μM im Finale
Carbonilcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)	Sigma	Nr. C2920	0,5 μM im Finale
Rotenon	Sigma	Nr. R8875	1,0 μM im Finale
Antimycin A	Sigma	CAS 1397-94-0	1,0 μM im Finale
Tellerwaschstation	Seepferdchen-Biowissenschaften
Bioanayzer für extrazellulären Fluss	Seepferdchen-Biowissenschaften	XFe96
Extrazelluläre Flussmittel-Zellkulturplatte	Seepferdchen-Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 102416-100
Kartusche für extrazelluläre Flusssensoren	Seepferdchen-Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 102416-100
Extrazelluläre Flussmittel-Kalibrierungslösung	Seepferdchen-Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 100840-000
Extrazelluläres Fluss-Assay-Medium	Seepferdchen-Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 102365-100	PH-Wert vor dem Assay gepuffert