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>1. Saatgut und Behandlung von zerebralen vaskulären endothelialen (CVE) Zellen auf Zellkulturplatten
- Aussaat von CVE-Zellen (bEnd.3-Zellen) auf einer extrazellulären 96-Well-Flux-Zellkulturplatte: 80 μl/Well. Stellen Sie die Zellkulturplatte bei 37 °C in einen 5 % CO2 -Inkubator. Hinweis: 16 × 103 Zellen pro Vertiefung erreichen innerhalb von 24 Stunden eine Konfluenz von 60 - 80 %.
- Wenn die Zellen einer Chemikalie ausgesetzt sind, fügen Sie die Behandlungen hinzu, sobald die Zellen am Plattenboden befestigt sind (8 - 24 Stunden nach der Aussaat).
Anmerkung: Bei Transfektionsexperimenten sollten Sie keine Antibiotika in ein vollständiges Wachstumsmedium geben.
>2. Beurteilung der mitochondrialen Funktion mit dem Bioanalyzer
- Vor Beginn des Assays hydratisieren Sie eine extrazelluläre Flussmittelsensorkartusche mit Kalibrant, indem Sie 150 μl extrazelluläre Flussmittelkalibrantlösung auf die Platte geben und über Nacht bei 37 °C ohne CO2 inkubieren.
- Wechseln Sie das Zellkulturmedium mit der Plattenwaschstation in ein extrazelluläres Flussmittel mit einem pH 7,0. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C ohne CO2 für 30 - 60 min.
- Bereiten Sie Arbeitslösungen von 8 μM Oligomycin, 4,5 μM Carbonilcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), 10 μM Rotenon und 10 μM Antimycin A in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) vor. Laden Sie 25 μl der Stammlösungen in die Patroneninjektionsöffnungen: Anschluss A, Oligomycin; Anschluss B, FCCP; Port C, Rotenon und Antimycin A mit extrazellulärem Fluss-Assay-Medium. Implementieren Sie das Assay-Protokoll wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Legen Sie die hydratisierte Kartusche in den Bioanalysator und führen Sie die Kalibrierung durch, indem Sie auf die Schaltfläche "Start" klicken. Entfernen Sie nach Abschluss der Kalibrierung die Bodenplatte der Patrone und legen Sie die Zellenplatte ein, indem Sie auf die Eingabeaufforderung "Patrone entladen" klicken. Setzen Sie den Assay fort, bis alle Messungen abgeschlossen sind.
- Öffnen Sie die Datendatei und beziehen Sie die Ratenwerte aus dem Bioanalysator. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei.
Tabelle 1. Das Instrument Run Protocol.
