Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präparation des Nervus jejunalis afferentus
- Führen Sie eine Nagetier-Euthanasie des jugendlichen oder erwachsenen Nagetiers durch, die vor dem Versuch von der örtlichen Ethikkommission genehmigt wurde (z. B. terminale Sedierung mit anschließender Herzpunktion, Gebärmutterhalsluxation usw.).
Anmerkung: Wir nutzten die Zervixluxation, um die Tiere zu töten, was zu Experimenten führte, ohne dass eine weitere Anästhesie oder postoperative Versorgung erforderlich war, da das Gewebe in vitro weiterverarbeitet wurde.
Anmerkung: Es hat sich gezeigt, dass das Alter die mesenterialen afferenten mechanosensorischen Funktionen abschwächt, daher raten wir den Forschern, sich für die Dauer eines einzigen Experiments an eine bestimmte Altersgruppe zu halten.
- Bringen Sie das getötete Versuchstier in Rückenlage und führen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt durch die Bauchmittellinie durch die Haut und die Bauchmuskelschicht durch, der sich vom Xiphoid-Prozess bis zum Schambein erstreckt.
- Baden Sie die Bauchhöhle mit kalter Krebslösung, um ein Austrocknen des intraabdominalen Gewebes zu verhindern (Krebszusammensetzung: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH2PO4, 15,43 mM NaHCO3, 1,21 mM MgSO4, 11,52 mM D-Glucose und 1,52 mM CaCl2).
Das - gesamte Jejunum wird mit einer scharfen Schere schnell herausgeschnitten, indem etwa 20 cm des Dünndarms unmittelbar distal der Zwölffingerdarmflexur herausgeschnitten werden, wobei darauf zu achten ist, dass die umgebenden Strukturen nicht beschädigt werden und das Mesenterium des Darms, das die jejunalen Blutgefäße und afferenten Nerven enthält, intakt bleibt
Anmerkung: Für die reine Jejunaldissektion in der Bauchhöhle braucht man kein Stereomikroskop zu verwenden, da dies mit bloßem Auge gut sichtbar gemacht werden kann.
- Legen Sie das herausgeschnittene Jejunum in eine eiskalte Krebslösung und halten Sie es auf Eis, während Sie die Krebslösung kontinuierlich mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) sauerstoffreichen.
- Schneiden Sie das Jejunum mit einer scharfen Schere in ca. 3 cm lange Schlaufen. Beobachten Sie das Mesenterialbündel, das die Gefäße und den Nervus splanchnicus enthält, irgendwo in der Nähe des Zentrums der jeweiligen Schleife.
- Spülen Sie jedes Segment mit Krebslösung und verwenden Sie einen stumpfen Katheter, um den luminalen Inhalt und den Speisebrei zu entfernen, da diese Verdauungsenzyme enthalten, die die Verschlechterung der Gewebeprobe in vitro beschleunigen.
Anmerkung: Achten Sie darauf, das Lumen der Schleife während des Spülens nicht zu beschädigen, da die Zerstörung der Zotten zur Freisetzung von Mediatoren führt, die die Aktivität des afferenten Nervs verändern können.
- Identifizieren Sie das Segment zur Messung der Aktivität des Nervus afferent (z. B. das erste Jejunalsegment distal des Treitz-Bandes oder die Zwölffingerdarmflexur) und platzieren Sie dieses in einer speziell angefertigten Aufnahmekammer, die mit einer Silikonelastomerschicht beschichtet ist.
Anmerkung: Der Beginn des Jejunums ist anatomisch definiert als der Teil des Dünndarms, an dem das Treitz-Band den Dünndarm kreuzt, auch Duodenojejunalflexur genannt.
Anmerkung: Decken Sie den Boden der Aufnahmekammer rechtzeitig vor Beginn des Experiments mit einer dünnen Silikonelastomerschicht ab. Bereiten Sie diese Elastomerschicht gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Die Kammer wird ständig mit warmer, karbogenierter Krebslösung mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min durchströmt und die Krebstemperatur in der Aufnahmekammer konstant bei 34 °C gehalten.
- Montieren Sie das Jejunalsegment im Organbad so, dass das orale Ende mit dem Spritzentreiber verbunden ist, der den luminalen Fluss liefert, und das aborale Ende mit dem Ausfluss verbunden ist. Dehnen Sie das Segment leicht, aber achten Sie darauf, keine übermäßige Spannung auszuüben. Befestigen Sie beide Enden mit 4/0-Seidenligaturen fest an den Ein- und Auslassöffnungen.
- Befestigen Sie den Spritzentreiber an der oralen Seite und perfundieren Sie das Jejunalsegment intraluminös mit Krebslösung (sauerstofffrei, Umgebungstemperatur) mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h.
- Verwenden Sie Insektenstifte, um das Mesenterium des montierten Darmsegments flach gegen die untere Schicht des Silikonelastomers zu drücken. Strecken Sie das Mesenterium, um die Visualisierung des Mesenterialbündels zu optimieren. Üben Sie keine Belastung auf das Bündel oder das Jejunum aus.
- Führen Sie eine Testrampendehnung (vide infra) durch, indem Sie die Ausgangsöffnung schließen, bis der intraluminale Druck des Darmsegments 60 mmHg erreicht, um sicherzustellen, dass keine intraluminale Krebslösung aus dem montierten Segment austritt. Beobachten Sie einen sanften Anstieg des intraluminalen Drucks ohne Unterbrechungen.
- Beobachten Sie kleine Kontraktionen des Segments (peristaltische Wellen) während der anfänglichen Dehnungsphase. Blockieren Sie bei Bedarf die peristaltische Aktivität, indem Sie der Krebs-Lösung 1 μM des L-Typ-Kalziumkanalblockers Nifedipin zusetzen.
Anmerkung: Die Zugabe von 1 μM Atropin zur Krebslösung zusätzlich zu Nifedipin lähmt das Darmsegment vollständig.
- Beginnen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig, das Fettgewebe vom Mesenterium abzuziehen, indem Sie vorsichtig mit zwei kleinen Pinzetten daran ziehen, wobei Sie darauf achten, die im Fettgewebe vergrabenen Gefäße und afferenten Nerven nicht zu beschädigen.
- Beginnen Sie in einiger Entfernung vom Jejunum und legen Sie beide Blutgefäße im Mesenterialbündel frei.
- Beobachten Sie den Nervus jejunus afferent zwischen beiden Gefäßen als dünnen, weißen Faden, der im Fettgewebe eingekapselt ist. Präparieren Sie nur dann proximal in Richtung Jejunum, indem Sie das Fettgewebe vorsichtig mit einer Pinzette abziehen, wenn die erste Identifizierung beider Mesenterialgefäße und/oder des Nervus afferent schwierig ist.
- Präparieren Sie den Nervus mesenterialis jejunus des Segments frei über eine Strecke von mehreren Millimetern, indem Sie das am Nerv anhaftende Fettgewebe entfernen.
- Durchschneiden Sie den Nerv mit einer scharfen Gewebeschere. Ziehen Sie bei Bedarf das restliche Fett und Bindegewebe sowie die epineuronale Hülle ab, indem Sie mit der kleinen Pinzette vorsichtig daran ziehen.
- Senken Sie mit einem Mikromanipulator die Spitze der Saugelektrode, die mit einer Spritze mit einem Kolben verbunden ist, in das Organbad ab und saugen Sie dann durch Manipulieren des Kolbens vorsichtig etwas Krebslösung aus dem Organbad ab, so dass die Spitze der Elektrode in die Krebslösung eingetaucht wird (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Krebs-Lösung die Drahtelektrode in der Saugelektrode bedeckt.
Anmerkung: Bereiten Sie mit einem Pipettenabzieher die Saugkapillare aus Borosilikatglas vor, in der sich die Drahtelektrode befindet, bevor das Experiment beginnt.
- Positionieren Sie die Spitze der Saugelektrode unmittelbar neben dem durchtrennten afferenten Nervenstrang und ziehen Sie den durchtrennten Nervenstrang über seine gesamte Länge in die Kapillare hinein.
- Manövrieren Sie die Spitze der Elektrode in Richtung eines Fettgewebes und saugen Sie dieses in die Glaskapillare ab, während Sie mit dem Kolben fest aspirieren, wodurch der Nerv in der Kapillare mechanisch vom Inhalt des Organbads "versiegelt" wird.
- Verifizieren Sie die Aufzeichnung der Aktivität des afferenten Nervs mit dem Datenerfassungssystem, z. B. durch eine durch Rampendehnung induzierte Erhöhung des afferenten Feuerns (siehe unten). Nach der Isolierung des Nervs in die Saugelektrode stabilisieren Sie das Präparat für 15 Minuten, um einen stabilen Zustand der spontanen afferenten Nervenaktivität zu erhalten, bevor Sie die eigentlichen Experimente durchführen.
- Um eine Rampendehnung durchzuführen, dehnen Sie das Darmsegment auf, indem Sie die Ausgangsöffnung schließen, was zu einem allmählichen Druckanstieg (bis zu 60 mmHg) führt. Führen Sie das gewünschte Versuchsprotokoll nur durch, wenn drei aufeinanderfolgende Rampendehnungen (im Abstand von 15 Minuten) zu einer reproduzierbaren Entladung mehrerer Einheiten führen (Abbildung 2).
