Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von vomeronasalen sensorischen Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Ackels, T., et al. Eingehende physiologische Analyse definierter Zellpopulationen in akuten Gewebeschnitten des Vomeronasalorgans der Maus. J. Vis. Exp. (2016)

Das Protokollvideo beschreibt die Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von den sensorischen Neuronen des vomeronasalen Organs (VNO) in Mäusen. Ein koronaler VNO-Schnitt mit fluoreszenzmarkierten sensorischen Neuronen wird in einem Aufnahmeaufbau platziert. Ein markiertes Neuron wird mit einer Aufzeichnungspipette in einer Ganzzellkonfiguration gepflastert, um die elektrophysiologische Aufzeichnung als Reaktion auf chemische Reize

zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Vorbereitung der Lösung

1. Extrazelluläre Lösung S₁ herstellen: 4-(2-Hydroxy-ethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) gepufferte extrazelluläre Lösung, die (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7,3 (angepasst mit NaOH); Osmolarität = 300 mOsm (angepasst mit Glukose).
2. Extrazelluläre Lösung S₂ wird hergestellt: Carbogen-sauerstoffhaltige (95 % O₂, 5 % CO₂) extrazelluläre Lösung, die (in mM) ....

Ergebnisse

Abbildung 1: Zerlegung des VNO. (A) Seitenansicht des Mauskopfes, um die Position und den Winkel zu veranschaulichen, in dem die Schneidezähne geschnitten werden. (B) Ventrale Ansicht, die den besten Punkt darstellt, um den oberen Gaumen zu greifen und zurückzuziehen (UP). (C) Ventraler Blick auf die Knorpelkapsel (CC), die das VNO und den Vomerkn.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemikalien
Agarose (niedrige Geliertemperatur)	PeqLab	Nr. 35-2030
ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	Nr. A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES)	Sigma-Aldrich	Nr. B9879
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1016
Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E3889
Traubenzucker	Sigma-Aldrich	Nr. G8270
GTP (Na-GTP)	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 51120
(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)	Sigma-Aldrich	Nr. H3375
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. 9333
Kaliumhydroxid	Sigma-Aldrich	Nr. 3564
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. S7653
Natriumhydrogencarbonat	Sigma-Aldrich	Nr. S5761
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	Nr. S8045
Chirurgische Instrumente und Verbrauchsmaterialien
Große Petrischale, 90 mm	VWR		Enthauptung, Dissektion der VNO-Kapsel
Kleine Petrischale, 35 mm	VWR		Deckel für VNO-Dissektion, Schale zum Einbetten in Agarose
Scharfe große chirurgische Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		Enthauptung, Entfernung des Unterkiefers
Starke Knochenschere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		Schneideschneidezähne
Mittlere Pinzette, Dumont Pinzette #2	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		Entfernung von Haut und Gaumen
Mikro-Federschere, 8,5 cm, gebogen, 7 mm Klingen	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		VNO ausschneiden
Zwei Paar feine Pinzetten, Dumont Pinzette #5	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		Präparieren von VNO aus der Knorpelkapsel
Kleiner Spachtel aus Edelstahl	Werkzeuge für die Feinwissenschaft		Handhabung von Agarose-Block- und Gewebeschnitten
Chirurgisches Skalpell			Schneiden des Agarose-Blocks in pyramidenförmige Form
Ausrüstung
Verstärker	HEKA Elektronik	EPC-10
Kapillaren aus Borosilikatglas (1,50 mm AD/0,86 mm ID)	Wissenschaftliche Produkte
CCD-Kamera	Leica Mikrosysteme	DFC360FX
Filterwürfel, Anregung: BP 450-490, Unterdrückung: LP 515	Leica Mikrosysteme	I3
Leuchtstofflampe	Leica Mikrosysteme	EL6000
Magnetrührer für Heizplatten	Snijders	Artikel-Nr.: 34532
Mikroschmiede	Narishige	MF-830
Mikromanipulator-Gerät	Luigs & Neumann	SM-5
Mikropipettenabzieher, vertikal zweistufig	Narishige	PC-10
Mikroskop	Leica Mikrosysteme	CSM DM 6000 SP5
Geräuschabblender 50/60 Hz (HumBug)	Quest Wissenschaftlich
objektiv	Leica Mikrosysteme	HCX APO L20x/1,00 W
Oszilloskop	Tektronik	TDS 1001B
Osmometer	Gonotec	Osmomat 030
Perfusionssystem 8-in-1	AutoMate Scientific
pH-Messgerät fünf einfach	Mettler Toledo
Pipetten-Vorratsdose	Welt Präzisionsinstrumente	Nr. E212
Aufnahmekammer	Luigs & Neumann	Scheiben-Minikammer
Rasierklingen	Wilkinson Sword GmbH	Wilkinson Schwert Classic
Sauerstoffhaltige Scheibenspeicherkammer; alternative kommerzielle Kammern sind z.B. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) oder die Vorkammer (BSC-PC; Warner Instruments)	maßgearbeitet
Stereomikroskop	Leica Mikrosysteme	S4E
Trigger-Schnittstelle	HEKA Elektronik	TIB-14 S
Vibratom	Leica Mikrosysteme	VT 1000 S
Wasserbad	Memmert	WNB 45

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