Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung der experimentellen Lösung und Ausrüstung für die Aufzeichnung von MEA (Multielectrode Array)
- Bereiten Sie künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit vor (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH2PO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3 und 10 mM Glukose, blasig mit 95 % O2 und 5 % CO2).
- Verwenden Sie zwei Arten von MEA-Sonden: 6 x 10 planare MEA und 8 x 8 MEA. Die erste Sonde deckt die Region ab, die den Kortex, das Striatum und den Thalamus umfasst. Die letztere Sonde deckt nur die kortikale Region ab.
- Verwenden Sie einen 60-Kanal-Verstärker mit einem Bandpassfilter, der auf 0,1 Hz bis 3 kHz bei 1.200 Verstärkung eingestellt ist. Erfassen Sie Daten mit einer Abtastrate von 10 kHz.
- Platzieren Sie zwei AgCl-beschichtete Silberdrähte in der MEA-Kammer für DCS (Gleichstromstimulation). Verwenden Sie dann die AgCl-beschichteten Silberdrähte, um elektrische Felder zu erzeugen, die von einem isolierten Stimulator erzeugt werden.
- Platzieren Sie eine Wolframelektrode (Durchmesser, 127 μm; Länge, 7,62 cm; 8° AC konische Spitze; Widerstand, 5 MΩ) für die Thalamusstimulation und platzieren Sie die Referenzelektrode in der MEA-Kammer. Geben Sie die Ströme der Wolframelektrode mit einem isolierten Stimulator ab, der von einem Impulsgenerator gesteuert wird (Abbildung 1).
>2. Vorbereitung von Gehirnschnitten
- Verwenden Sie männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen. Halten Sie die Tiere in einem klimatisierten Raum (21-23 °C; 50 % Luftfeuchtigkeit; 12 Stunden/12 Stunden Hell-/Dunkelzyklus, Licht an um 8:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
- Entnehmen Sie ein Aliquot von 250 ml des in Schritt 1.1 hergestellten aCSF und geben Sie es in ein mit Eis gefülltes Becherglas. Gleichzeitig liefern Sie kontinuierliches Gas, das aus 95 % O2 und 5 % CO2 besteht.
- Chirurgie
- Betäuben Sie das Tier mit 4% Isofluran in einem Glaskasten für ca. 3 min. Sobald das Tier eine chirurgische Narkosetiefe erreicht hat (erkennbar an einer fehlenden Reaktion auf das Einklemmen der Zehen), legen Sie es auf ein flaches Tablett, das mit zerstoßenem Eis gefüllt ist, und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere.
- Legen Sie den Schädel frei und schneiden Sie den restlichen Muskel ab. Als nächstes schälen Sie mit Rongeuren die dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn ab. Schneide die Seiten des Schädels mit Rongeuren ab. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit einer 75%igen Ethanollösung.
- Schneiden Sie mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns und entfernen Sie das Gehirn. Nach der Enthauptung und übertragen Sie das Gehirn schnell in ein Becherglas, das mit eiskaltem, sauerstoffreichem aCSF gefüllt ist.
- Präparation des medialen Thalamus (MT)-ACC (anterior cingulater Kortex) Brain Slice
Anmerkung: Bereiten Sie Slices vor, die den Weg von der MT zum ACC enthalten
- Schneiden Sie den Hirnblock von Hand mit zwei sagittalen Schnitten 2,0 mm lateral der Mittellinie in jeder Hemisphäre, um die subkortikale Anatomie darzustellen. Machen Sie dann zwei abgewinkelte Schnitte. Machen Sie den ersten Querschnitt parallel zum sichtbaren Fasertrakt im Striatum.
- Machen Sie den zweiten Schnitt von der Verbindung zwischen dem Kleinhirn und der Sehrinde bis zum Mittelpunkt zwischen der vorderen Kommissur und dem Tractus opticus, die ventral und parallel zur Thalamocingulatbahn verlaufen.
- Befestigen Sie den Hirnblock mit Cyanacrylatkleber an einer eckigen Platte (~120°) und machen Sie einen Schnitt knapp über dem Wendepunkt der Bahn. Falten Sie die Platte auf, drücken Sie sie flach und kleben Sie sie auf die Kammerstufe eines Vibratoms.
- Machen Sie mediale Thalamus-ACC-Hirnschnitte (500 μm dick) und tauchen Sie sie dann in eiskalten, sauerstoffhaltigen aLiquor. Übertragen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer und halten Sie sie 1 Std. lang bei 32 °C unter kontinuierlicher Perfusion (12 ml/min) mit sauerstoffhaltigem aLiquf.
>3. Vorbereitung der Perfusionskammer für die Aufzeichnung von Multielektrodenarrays
- Vorbereitung der Perfusionskammer
- Platzieren Sie eine MEA-Sonde auf einem Mehrkanalsystem und verwenden Sie zwei separate Polyethylenschläuche, um die Sonde an eine Peristaltikpumpe anzuschließen. Verwenden Sie ein Röhrchen, um das aLiquf in die MEA-Kammer zu führen, und das andere Röhrchen, um das aLiquf aus der Kammer zu führen. Zum Schluss wird das Präparat kontinuierlich mit warmem (29-30 °C) sauerstoffhaltigem aCSF (8 ml/min) perfundiert.
- Gehirnschnitt auf MEA übertragen. Halten Sie die Gehirnscheibe auf dem MEA mit einem feuchten Wattestäbchen fest. Bewegen Sie die Gehirnscheibe vorsichtig, um sicherzustellen, dass der ACC über den Elektroden ausgerichtet ist.
- Verwenden Sie Slice-Anker-Kits und Hold-Downs, um den Brain-Slice zu drücken. Dieser Schritt sorgt für eine gute elektrische Verbindung zwischen der Scheibe und den Elektroden.
>4. Erzeugung elektrischer Felder durch DCS
Hinweis: Die Definition der elektrischen Feldorientierung basierte auf der Richtung der axodendritischen Achse im ACC. Die Orientierungen der Dendriten- und Soma-Kompartimente wurden mit Hilfe der Golgi-Färbung bestätigt12.
- Platzieren Sie die AgCl-Elektrode (definiert als Anode) proximal zum ACC und platzieren Sie die andere Elektrode (definiert als Kathode) distal zum ACC. Zeichnen Sie die Feldstärke auf, die durch die beiden Feldausrichtungen (parallel und senkrecht zu den axodendritischen ACC-Fasern) durch die MEA erzeugt wird, und geben Sie die Ströme der elektrischen Felder mit einem Stimulator ab.
- Bestimmen Sie den Abstand der AgCl-Elektroden (ca. 1,5-2 cm) und stellen Sie die Stromstärke des Stimulators so ein, dass der DCS zwischen 0,5 und 2 mA liegt.
>5. Elektrisch induzierte kortikale synaptische Reaktionen
Hinweis: Induzieren synaptische Reaktionen im ACC durch elektrische Stimulation im MT, in dem ein programmierbarer elektrischer Stimulusgenerator rechteckige biphasische Stromimpulse erzeugt.
- Wiederholen Sie Abschnitt 3 oben.
- Platzieren Sie eine Wolframelektrode in der MT und geben Sie Impulse vom Stimulator über bipolare Wolframelektroden an den thalamischen Bereich der Schnitte ab.
- Verwenden Sie verschiedene Stromstärken, um den Schwellenwert zu bestimmen, der eine ACC-Reaktion auslöst. Verwenden Sie hier eine Intensität von ±150 μA und eine Dauer von 200 μsec, was in den meisten Schichten eine maximale Reaktion von 80 % im ACC hervorrief.
- Bewegen Sie die Wolframelektrode entlang des thalamozingulären Weges (von MT zu Corpus Callosum) in der MT-ACC-Schicht, um die optimalen Reaktionsprofile zu erhalten.
- Machen Sie 10-20 Sweeps von ACC-Antworten und verwenden Sie die Software, um automatisch alle ACC zu mitteln, die durch die MT-Stimulation hervorgerufen werden. Das Ergebnis sind die synaptischen Reaktionen in ACC, die durch die MT-Stimulation durch den MT-ACC-Signalweg induziert werden.
>6. Elektrisch induzierte anfallsähnliche Aktivität
Hinweis: Die anfallsähnliche Aktivität wurde durch die Anwendung von 4-Aminopyridin (4-AP; 250 μM) und Bicucullin (5 μM) induziert. Frühere zeitkontrollierte Studien zeigten, dass maximale und stabile Reaktionen 2-3 Stunden nach der Verabreichung des Medikaments auftraten14.
- Wiederholen Sie Abschnitt 5 oben.
- Fügen Sie der Perfusionslösung Medikamente hinzu. Verwenden Sie 4-AP (4-Aminopyridin) (250 μM) und Bicucullin (5 μM). Mischen Sie die Medikamente gleichmäßig und setzen Sie die Perfusion für 2-3 Stunden fort.
- Um anfallsähnliche Aktivitäten zu erleichtern, halten Sie die Perfusionspumpe auf einer relativ schnellen Perfusionsrate (8 ml/min), was auch dazu beitragen kann, den Aufbau eines pH-Gradienten zu verhindern.
- Platzieren Sie eine Wolframelektrode in der MT und führen Sie eine elektrische Stimulation (150 μA, 200 μs Dauer) durch, um ACC-Reaktionsprofile zu erhalten.
- Machen Sie 10-20 Sweeps und mitteln Sie die Antworten.
- Ersetzen Sie die Perfusionslösung durch frischen Liquor, um die Medikamente auszuwaschen. Wiederholen Sie Schritt 6.5.
