Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Arzneimittel zur Mikroiontophorese
HINWEIS: Die Medikamente, die für die Mikroiontophorese verwendet werden, müssen eine elektrische Ladung haben, wenn sie in Wasser aufgelöst werden. Überprüfen Sie die Literatur, um zu sehen, ob das Medikament von Interesse für dieses Verfahren geeignet ist. Hier wird das Vorgehen bei Gabazin, einem Antagonisten des GABA-A-Rezeptors, beschrieben.
- Filtern Sie destilliertes Wasser mit einem 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter, um es zu sterilisieren und sicherzustellen, dass es keine gelösten Stoffe enthält. Bereiten Sie mit diesem destillierten Wasser ~1.000 μl 20 mM Gabazin vor.
- Stellen Sie den pH-Wert der Verdünnung mit 0,2 μm gefiltertem NaOH mit einer pH-Elektrode mit feiner Spitze auf 4 ein.
- 100 - 200 μl Aliquots bei -20 ºC lagern. Am Tag der Aufnahme auftauen. An diesem Tag, bevor das Tier fixiert wird, füllen Sie die Fässer (3 - 5 μl) der Mehrfachelektrode mit den Medikamenten, wobei Sie eine 100-μl-Mikrospritze verwenden, die mit einer flexiblen Kunststoffnadel versehen ist.
>2. Chirurgie und Kopfpostenimplantation
- Durchführung von Experimenten an zwei männlichen CBA/J-Mäusen (Mus musculus) mit einem Gewicht von 27 und 30 g.
- Fassen Sie die Tiere in den Tagen vor der Operation an und lassen Sie sie in der Aufnahmekammer frei erkunden, um sie daran zu gewöhnen. Führen Sie drei Sitzungen pro Tag durch, die jeweils mindestens 30 Minuten dauern. Dadurch werden sie beruhigt und fühlen sich während der Aufnahmen wohl.
- Betäuben Sie die Maus mit einer Mischung aus Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg), die intramuskulär injiziert wird. Diese Dosis betäubt das Tier für etwa 1 Stunde tief. Geben Sie bei Bedarf zusätzliche Dosen von einem Drittel der Anfangsdosis.
- Legen Sie das Tier auf eine Heizdecke, die auf eine Temperatur von 38 ± 1 ºC eingestellt ist, und stabilisieren Sie den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen mit zwei Ohrstangen und einer Beißstange. Achte darauf, dass du das Trommelfell nicht mit den Ohrbügeln durchbohrst.
- Schützen Sie die Augen, indem Sie einen Tropfen Augengel auftragen.
- Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer Schere und tragen Sie Povidon-Jod auf, um die Haut zu desinfizieren.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen und das Periost zurückzuziehen, das den parietalen und den rostraleren Teil des Hinterhauptbeins bedeckt.
- Kleben Sie eine leichte Duraluminium-Kopfstütze (Gewicht ~0,65 g, Länge 30 mm, Abbildung 1A) mit runder und flacher Basis (5 mm Durchmesser) auf den Schädel. Klebe einen Silberdraht in die Mitte des Kopfpfostens und lasse die Enden frei. Der Silberdraht wird als Referenzelektrode für die elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet.
- Tragen Sie eine dünne Schicht lichthärtenden Kleber auf den Schädel und die Basis der Kopfstütze auf. Warten Sie 10 Sekunden und platzieren Sie den Kopfpfosten über dem rostralen Bereich der Scheitelknochen entlang der Mittellinie.
- Härten Sie den Klebstoff mit einer blauen Lichtquelle 20 Sekunden lang aus, um eine effektive Haftfestigkeit zu erzielen.
- Bohren Sie mit einer Bohrmaschine und einem kleinen Bohrer drei Löcher um und hinter der Basis des Kopfpfostens.
- Platzieren Sie zwei Uhrenschrauben (~2 mm Länge) in den Bohrlöchern, die als zusätzliche Kontaktpunkte zwischen dem Schädel und dem Kopftisch dienen. Die Schrauben benötigen 11/2 Umdrehungen, um einen festen Sitz zu erreichen. Testen Sie die Schrauben mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass sie nicht locker sind.
- Führen Sie die Spitze des silbernen Erdungskabels in das dritte Loch ein und stellen Sie sicher, dass es die Dura berührt. Trage einen kleinen Tropfen wasserfesten Cyanacrylatkleber auf, um den Draht mit dem Schädel zu verbinden.
- Tragen Sie lichthärtendes Komposit auf, um die Verbindung des Kopfpfostens mit dem Schädel zu verstärken. Decken Sie die Basis der Kopfstütze, den unteren Teil des Silberdrahts und die Schrauben ab und achten Sie darauf, dass sie nicht hinter das Lambda ragen, um den Zugang während der Aufnahme zu ermöglichen. Mit einer blauen Lichtquelle aushärten.
- Ziehen Sie den Muskel im Nacken in der Nähe seines Ansatzes am Schädel zurück. Bohren Sie mit einem kleinen Trepan (2,35 mm Durchmesser) ein rundes Fenster direkt unter der Lambda-Naht und lateral der Mittellinie, um den Colliculus Colliculus inferior (IC) freizulegen. Ziehen Sie den Deckknochen mit einer feinen Pinzette nach oben, wenn die Ränder locker sind. Wenn Blutungen auftreten, spülen Sie sie mit kalter, steriler Kochsalzlösung aus, um sie zu stoppen.
- Verwenden Sie Komposit, um eine kleine (~1 mm breite und ~1 mm hohe) Wand um das Fenster zu machen und sie lichthärtend zu machen.
- Bedecken Sie den freiliegenden Schädel und die Muskeln mit antibiotischer Salbe. Befeuchten Sie dann die freiliegende Oberfläche des IC mit steriler Kochsalzlösung und bedecken Sie sie mit Vaseline, indem Sie die Vertiefung füllen, die nach dem Erstellen der Wand um das Aufnahmefenster entsteht.
- Injizieren Sie Buprenorphin subkutan (0,03 mg/kg, 1:10 verdünnt in steriler Kochsalzlösung) als Analgetikum.
- Lassen Sie das Tier auf der Heizdecke, bis es aufwacht, und bringen Sie es drei Tage lang in seinen Käfig zurück, um sich von der Operation zu erholen, bevor Sie die Sitzungen aufnehmen. Halten Sie Tiere in einem einzelnen Rattenhaltungskäfig unter, um zu verhindern, dass Käfiggenossen das Gelee reinigen und der Kopfpfosten die Metallgitterabdeckung berührt. Platzieren Sie etwas Anreicherung im Käfig, wenn das Tier in einer Einzelhaltung untergebracht ist. Wechseln Sie auch das Sägemehl täglich, um Infektionen zu vermeiden, und überprüfen Sie sorgfältig, ob sich das Tier richtig erholt und keine Anzeichen von Beschwerden zeigt. Überprüfen Sie auch, ob sich Vaseline über dem Aufnahmefenster befindet, um das freiliegende Gehirn zu schützen.
>3. Elektrophysiologische Aufzeichnung und Mikroiontophorese
- Geben Sie dem Tier nach der Genesung Zeit, sich an die Aufnahmeumgebung zu gewöhnen, und lassen Sie seinen Kopf zurückhalten. Akklimatisieren Sie das Tier, indem Sie die Kopfstütze an der Halterung befestigen, während die Maus auf einem speziell angefertigten, gepolsterten Schaumstoff-Rückhaltesystem sitzt, das auf ihre Körpergröße zugeschnitten ist (Abbildung 1B). Dies schränkt die Bewegungen der Maus ein und trägt zu ihrer Ruhe bei.
- Beginnen Sie mit 10-minütigen Sitzungen und erhöhen Sie die Dauer schrittweise auf bis zu 120 Minuten. Belohnen Sie die Tiere während der Sitzung in bestimmten Abständen mit süßen Flüssigkeiten (Kondensmilch, 30:70 in Wasser verdünnt). Geben Sie später, während der Aufzeichnungssitzung, die gleiche Belohnung zu Beginn und am Ende der Sitzung oder während kein Neuron isoliert ist.
- Wenn das Tier vor der Aufzeichnung erregt ist, injizieren Sie das milde Beruhigungsmittel Acepromazin (2 mg/kg, intraperitoneal). Entsprechend dem interessierenden neuronalen System kann das Beruhigungsmittel Ihre Ergebnisse beeinflussen.
- Lassen Sie das Tier die Aufnahmekammer 5 - 10 Minuten lang frei erkunden.
- Legen Sie den Körper des Tieres in den speziell angefertigten, gepolsterten Schaumstoff (Abbildung 1B).
- Befestigen Sie die Kopfstütze an einer Halterung, die am stereotaktischen Rahmen befestigt ist (Abbildung 1C). Dies ist ein guter Zeitpunkt, um dem Tier eine flüssige Belohnung zu geben.
- Decken Sie den Körper des Tieres mit einer Baumwolldecke ab und befestigen Sie sie locker mit einem Plastikhalbzylinder und Klebeband.
- Nehmen Sie die Vaseline aus dem Aufnahmefenster und spülen Sie sie mit warmer, steriler Kochsalzlösung ab.
- Aufzeichnung der neuronalen Aktivität und der iontophoretischen Anwendung von Gabazin.
- Setzen Sie die Multibarrel-Elektrode auf ihre Halterung, die von einem Mikroantrieb gesteuert und an einem Mikromanipulator befestigt wird.
- Schließen Sie die Drähte für die Aufnahme mit kleinen Krokodilklammern an. Verbinden Sie den Pluspol mit dem Ende der Wolframelektrode und den Erdungsanschluss mit dem Silberdraht, der die Dura kontaktiert.
- Legen Sie einen unbeschichteten Silberdraht in jeden Zylinder, so dass ein Ende die Lösung berührt und das andere zugänglich ist. Verbinden Sie diese Enden mit dem Mikroiontophoresegerät und befolgen Sie dabei die Anweisungen des Herstellers.
- Bewegen Sie die mehrläufige Elektrode, bis die Spitze die Oberfläche des Gehirns berührt. Tragen Sie warme, sterile Kochsalzlösung auf, um das Austrocknen des Hirngewebes zu verhindern. Wenden Sie zu diesem Zeitpunkt einen Retentionsstrom an (-10 nA für Gabazin; überprüfen Sie die Literatur für das jeweilige Medikament), um ein Austreten des Arzneimittels aus der Zylinderspitze zu vermeiden, während nach Einzelaktivität gesucht wird.
- Verwenden Sie Standardtechniken zur Isolierung der extrazellulären Aktivität einzelner Neuronen. Ermitteln Sie den Frequenzgangbereich (FRA) des Neurons, d. h. die Kombination von Frequenzen und Intensitäten, die in der Lage sind, eine Reaktion hervorzurufen, da das Neuron auf diese Geräusche empfindlich reagiert.
- Wählen Sie zwei Frequenzen (f1 und f2), die eine ähnliche Zündrate und ein ähnliches Muster hervorrufen. Präsentieren Sie jede dieser Frequenzen als seltenen und sich wiederholenden Reiz unter dem seltsamen Paradigma.
Anmerkung: Kurz gesagt, im Oddball-Paradigma wird eine Frequenz (f1) als der sich wiederholende Reiz mit hoher Eintrittswahrscheinlichkeit dargestellt, während die zweite (f2) der selten auftretende abweichende Reiz ist, der zufällig zwischen den sich wiederholenden Reizen eingestreut ist. In einer zweiten seltsamen Sequenz werden die relativen Wahrscheinlichkeiten der beiden Reize vertauscht.
- Geben Sie das Gabazin frei, indem Sie den Strom auf positive Werte (10 - 20 nA) verschieben. Holen Sie sich die FRA erneut und wiederholen Sie das seltsame Paradigma unter der Gabazin-Anwendung. Halten Sie den Auswurf aufrecht, bis ein sichtbarer Effekt auf die Schussgeschwindigkeit beobachtet wird. Es dauert in der Regel 5 - 20 Minuten, abhängig vom jeweiligen Medikament, seiner Konzentration und der Größe des Auswurfstroms. Wiederholen Sie das Aufzeichnungsprotokoll, um die Werte unter der Wirkung des Arzneimittels zu erhalten.
- Stoppen Sie die Einspeisung, indem Sie den Strom auf die Beibehaltungswerte zurücksetzen. Warten Sie, bis die Wirkung des Medikaments verschwunden ist, indem Sie überwachen, ob die FRA oder die Reaktion auf das seltsame Paradigma zu den Kontrollwerten zurückkehrt.
Anmerkung: Die Aufzeichnungssitzungen können 2 - 3 Stunden pro Tag dauern und sollten früher beendet werden, wenn das Tier Anzeichen von Unwohlsein oder Schwierigkeiten zeigt. Geben Sie flüssige Belohnung und bedecken Sie die Aufnahmekammer mit Vaseline.
