Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität des neuronalen Netzwerks in einer Neuron-Astrozyten-Kokultur

Zusammenfassung

Quelle: Taga, A., et al. Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regional spezifischen humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Astrozyten und Neuronen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Neuron-Astrozyten-Co-Kultur zur Aufzeichnung der Aktivität neuronaler Netzwerke. Nach der Etablierung der Co-Kultur von Motoneuronen und Astrozyten auf einer Multi-Elektroden-Array-Platte (MEA) wurde die synchrone rhythmische elektrische Aktivität des neuronalen Netzwerks extrazellulär mit dem MEA aufgezeichnet.

Protokoll

>1. Co-Kultivierung von MN- und Rückenmarks-Astrozyten in Multi-Elektroden-Array-Platten

1. Differenzieren und plattieren Sie die Motoneuronen und Astrozyten, wenn sie am selben Tag verwendet werden können und auf Day in vitro (DIV) 60 für die Motoneuronen und DIV 90 für die Astrozyten gealtert sind.
2. Beschichten Sie die MEA-Platten am Tag vor oder am Tag der Beschichtung wie folgt, wenn Sie mit 24-Well-Kunststoffplatten arbeiten (Materialtabelle).
3. Verdünnen Sie Polyornithin (PLO) in Wasser oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf 100 μg/ml.
   1. Geben Sie 15-20 μl in jede Vertiefung (abhängig vom Pipettenkomfort) und bilden Sie ein Tröpfchen in der Mitte der Vertiefung, das den Bereich der Elektroden und den umgebenden Bereich, aber nicht die gesamte Vertiefung abdeckt.
   2. Achten Sie darauf, die Elektroden mit der Pipettenspitze nicht zu beschädigen. Seien Sie konsistent mit dem Volumen von Vertiefung zu Vertiefung, um sicherzustellen, dass in jeder Vertiefung die gleiche Oberfläche abgedeckt ist.
   3. PLO mindestens 1 h (vorzugsweise 2 h) bei 37 °C inkubieren.
      Anmerkung: Die kleinen Volumina trocknen aus, wenn nicht genügend Feuchtigkeit in den Platten vorhanden ist. Geben Sie Wasser in die Fächer, die die Brunnen umgeben, um eine ausreichende Luftfeuchtigkeit während des gesamten Beschichtungs- und Aufnahmeverlaufs zu gewährleisten.
4. Aspirieren Sie so viel PLO wie möglich mit einer Mikropipettenspitze aus Kunststoff. Achten Sie darauf, die Elektroden nicht zu berühren. Dreimal mit 250 μl Wasser waschen. Wenn Sie einen Vakuumsauger zum Waschen verwenden, lassen Sie die Spitze nicht in der Nähe des Elektrodenträgers. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen so viel Wasser wie möglich und verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze. Lassen Sie die Oberfläche unter der Zellkulturhaube trocknen und den Deckel abnehmen.
5. Sobald die Plattenoberflächen trocken sind, fügen Sie Laminin zu, verdünnt auf 10 μg/ml in PBS. Verwenden Sie 15-20 μl, um jedes Elektrodenarray abzudecken. Geben Sie Wasser in die Feuchtigkeitsfächer, setzen Sie den Deckel wieder auf und stellen Sie die Platte für mindestens 2 Stunden bis über Nacht auf 37 °C Inkubation.
6. Spülen Sie am Tag der Beschichtung das Motoneuron (MN) und die Astrozytenkulturen einmal mit PBS und fügen Sie Trypsin 0,05 % bei 37 °C hinzu, um die Zellen zu heben (5 Minuten). In ein konisches 15-ml-Röhrchen mit Trypsininhibitor und Waschplatten mit Medium oder Basis geben, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g und resuspendieren Sie mit einer 1000-μl-Pipette, um 1 ml einer Einzelzellsuspension zu erzeugen. Bei der Re-Suspendierung von MN und Astrozyten ist auf das Co-Kulturmedium umzuschalten (Tabelle 1) unter Zugabe von 20 μM Rho-assoziiertem Coiled-Coil-bildendem Protein Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor (ROCK-I).
7. Zählen Sie das MN und die Astrozyten parallel mit einem Hämozytometer. Während des Zählens und Rechnens verschließen Sie die Zellsuspensionen und legen Sie sie in ein Styroporgestell bei 4 °C.
8. Berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um die Kulturen auf eine Konzentration von 5 x 10⁴ Zellen pro 5 μl für Motoneuronen und 2,5 x 10⁴ Zellen pro 5 μl für Astrozyten zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die 1 mL Zellsuspensionen bei 300 x g für 5 min und resuspendieren Sie sie im berechneten Volumen.
9. Berechnen Sie die Anzahl der gewünschten Wells, die ausgesät werden sollen, und multiplizieren Sie sie mit 5 μl jeder Zellsuspension. Kombinieren Sie das erforderliche Volumen an Neuronen- und Astrozytensuspensionen im Verhältnis 1:1 und mischen Sie durch Pipettieren, bis es vollständig vermischt ist (normalerweise zweimal), aber vermeiden Sie es, zu aggressiv zu sein.
10. Entfernen Sie das Laminin mit einer Pipettenspitze aus jeder Vertiefung der MEA-Platte. Übertragen Sie 10 μl der endgültigen kombinierten Zellsuspension in jede Vertiefung und bilden Sie ein kleines Tröpfchen, das das Elektrodenarray bedeckt, um eine Zelldichte von 5 x 10⁴ MN und 2,5 x 10⁴ Astrozyten pro Vertiefung zu erreichen.
    Anmerkung: Die hohe Zelldichte in der kombinierten Suspension erfordert eine häufige Resuspension zwischen den Wells während des Seeding-Schritts, um genaue und konsistente Zellzählungen zu gewährleisten.
11. Stellen Sie die Platten für 20-30 Minuten wieder in den Inkubator. Achten Sie darauf, das Zelltröpfchen nicht zu stören und lassen Sie die Zellen erste Anheftungen auf den Platten bilden.
12. Nach 20-30 Minuten fügen Sie jedem Well ein warmes Co-Kulturmedium + ROCK-I hinzu, indem Sie 250 μl an der Wand jedes Wells pipettieren, gefolgt von weiteren 250 μl an der Wand desselben Wells auf der gegenüberliegenden Seite. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
13. Untersuchen Sie die Platten am Tag nach der Aussaat (Co-Kultur Tag 1). Wenn signifikante Zelltrümmer oder abgestorbene Zellen vorhanden sind, tauschen Sie das Medium gegen ein frisches Co-Kulturmedium aus, das ROCK-I enthält. Andernfalls wechseln Sie das Medium am zweiten Tag nach der Aussaat (Co-Culture Day 2) auf das Co-Kulturmedium ohne ROCK-I. Führen Sie zweimal pro Woche einen Austausch des halben Mediums durch (50 % aspirieren und 60 % des Endvolumens hinzufügen, um die Verdunstung zu berücksichtigen).
14. Bei Verwendung von MEA-Systemen mit 30-mm-Glasplatten mit einer Vertiefung (Materialtabelle) kann die Vorbereitung der Platte 2 oder mehr Tage dauern. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um dies durchzuführen.
15. Heben Sie die Zellen und Zelltrümmer aus den vorherigen MEA-Kulturen mit 0,05% Trypsin für 5-15 Minuten an.
16. Trypsin aspirieren und dreimal mit Wasser abspülen.
17. Sterilisieren Sie durch Zugabe von 70 % Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in der Haube. Aspirieren Sie das Ethanol und spülen Sie es dann dreimal mit Wasser ab.
18. 1% anionisches Reinigungsmittel mit Proteaseenzym in Wasser auftragen. Decken Sie die Teller mit einem Deckel ab und wickeln Sie sie mit thermoplastischer Folie und Aluminiumfolie ein und lassen Sie sie dann über Nacht bei Raumtemperatur auf einer Wippe liegen.
19. Saugen Sie das Reinigungsmittel an und spülen Sie es dann dreimal mit Wasser ab.
20. Wenn Sie die Platten aufbewahren möchten, fügen Sie eine ausreichende Menge Wasser hinzu. Decken Sie die Teller mit einem Deckel ab und wickeln Sie sie mit thermoplastischer Folie und Alufolie ein und lassen Sie sie bis zum nächsten Gebrauch im Kühlschrank.
21. Wenn Sie eine Beschichtung planen, lassen Sie die Oberfläche unter der Zellkulturhaube trocknen.
22. Wenn eine zusätzliche Sterilisation erforderlich ist (z. B. frühere Infektion oder nicht kürzliche Verwendung), setzen Sie die MEA-Platten nur zu diesem Zeitpunkt 30-60 Minuten lang ultraviolettem (UV) Licht unter der Haube aus.
    Anmerkung: Durch die Vermeidung von häufigem UV-Licht werden Schäden an den Elektroden vermieden. Die Verwendung von UV-Licht, wenn sich Platten mit Serum bedeckt haben, führt zu funktionsuntüchtigen Elektroden, weshalb es nur auf gereinigten Platten verwendet werden sollte.
23. Wenn die Platten vollständig getrocknet sind, fahren Sie mit der Plasmareinigung für 1 Minute fort, um die Glasoberfläche der MEA-Platten aufzuladen und die Beschichtungswirksamkeit zu verbessern. Plasmareinigung mindestens alle 4-5 Zyklen der MEA-Plattenreinigungs-Beschichtungszyklen.
    1. Wenn eine Plasmareinigung nicht durchführbar oder nicht gerechtfertigt ist, fügen Sie alternativ eine ausreichende Menge an fötalem Rinderserum (FBS)-haltigem Medium hinzu, um die Oberfläche der MEA-Platten zu bedecken, und stellen Sie sie über Nacht in den Inkubator zurück.
24. Verwenden Sie PLO (Polyornithin)/Laminin-Beschichtung. Geben Sie die PLO-Lösung (100 μg in PBS) unmittelbar nach der Plasmareinigung oder dem Ansaugen und Ausspülen des FBS-haltigen Mediums zu.
25. Plattieren Sie die Zellen wie oben beschrieben in den folgenden Dichten: 1 x 10⁵ humane Astrozyten aus pluripotenten Stammzellen (hiPSC-A) / Platte und 5 x 10⁵ humane pluripotente Stammzell-abgeleitete Motoneuronen (hiPSC-MN)/Platte.

>2. Aufzeichnung von Multi-Elektroden-Arrays

1. Extrahieren Sie die Rohspannungsdaten bei einer Abtastfrequenz von 12,5 kHz unter Verwendung eines Butterworth-Filters mit einem 200-Hz-Hochpass- und einem 3-kHz-Tiefpassfilter. Legen Sie die Spike-Erkennung als momentane Zeitpunkte von Spannungen ≥6 Standardabweichungen vom Ausgangswert fest. Identifizieren Sie Bursts als Aktivität mit >5 Spitzen in 100 ms. Definieren Sie die Netzwerkaktivität, wenn mehr als 35 % der gesamten aktiven Elektroden innerhalb von 100 ms mit mindestens 50 Spitzen pro Netzwerk-Burst ausgelöst werden.
2. Beginnen Sie so bald wie möglich nach dem Co-Culture (CC) Tag 1.
   Anmerkung: Elektrische Aktivität wird vor CC Tag 3 selten bemerkt.
3. Plattenparallele Kulturen mit ähnlichen Dichten und Replikaten in den entsprechenden Kulturplatten oder Deckgläsern für biochemische Assays, Immunzytochemie (ICC) oder quantitative PCR (qPCR).
4. Führen Sie Aufnahmen mit einer Temperatur von 37 °C und einem CO_2-Gehalt von 5 % durch. Übertragen Sie die Platten in die Maschine und lassen Sie sie vor der Aufnahme mindestens 5 Minuten lang äquilibrieren.
5. Zeichnen Sie die Basisaktivität entweder jeden zweiten Tag oder wöchentlich auf, je nach Versuchsdesign über 1-15 Minuten. Nehmen Sie nicht mindestens 1 h nach einem Medientausch auf und warten Sie idealerweise 24 h nach jedem Medienwechsel.
6. Um eine Kontamination zu vermeiden, ist ein Wechsel des Mediums (d.h. ein halber Mediumwechsel wie in Schritt 1.14) nach jeder Aufnahme, bei der der Deckel der Sterilplatte außerhalb der Sterilhaube geöffnet werden muss (d.h. das Auftragen von Wirkstoffen), vorzunehmen. Führen Sie einen vollständigen Medienwechsel und eine Spülung durch, um Medikamente auszuwaschen, wenn die Platten über die medikamentöse Behandlung hinaus weiter verwendet werden.
7. Verwenden Sie zu Analysezwecken mindestens drei technische und biologische Replikate für jede Erkrankung. Geben Sie elektrophysiologische Daten als Mittel von n ≥ 3 Replikationen aus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm sterile Kulturplatten	Falke	353003
25 cm2 sterile Kulturflaschen	Falke	353136
500 mL 0,2 μm CA-Filtersystem	Corning	430769
5 mL Pipette	Falke	357543
6 gut sterile Kulturplatten	Falke	Nr. 3046
Axion CytoView MEA 24 Platten (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA-Plattform	Axion	Maestro Edge
Grundstoff-Membran-Matrix - Matrigel	Corning	354277	Details im Protokoll
Tischmikroskop (steril unter der Zellkulturhaube)	Zeiss	Artikel-Nr.: 415510-1100-000	Primo Vert
Ziliärer neurotropher Faktor (CNTF)	Peprotech	Nr. 450-13	Löse 100 μg in 1 ml sterilem PBS auf und füge dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
CO2 -Tanks und Regler für Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	Thermofischer	Artikel-Nr.: 113300	Arbeitskonzentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Ergänzung	Thermofischer	A1517001	Kombinieren Sie 10 mL Essential 8 (10x) Nahrungsergänzungsmittel mit 500 mL Essential 8 Wachstumsmedium (1x)
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermofischer	16140071	Arbeitskonzentration 1x
Hämozytometer	Wahlmikroskopie Wissenschaften	Artikel-Nr.: 63510-20
Feuchtigkeitskontrollierter Zellkultur-Inkubator	ThermoFisher	370	eingestellt auf 37 ºC, 5 % CO2
Laminin	Thermofischer	Artikel-Nr.: 23017-015	Stammlösung 1 mg/ml, Arbeitskonzentration 10 μg/mL (Beschichtung), 1 μg/mL (Zellmedien)
L-Glutamin	Thermofischer	Artikel-Nr.: 25030	Löse 2 mg LDN in 500 μl Chloroform auf, um 10 mM Stamm zu erhalten. Aliquotieren Sie diese und frieren Sie sie bei -80 ºC ein. Verdünnen Sie zur Verwendung zuerst das Material 1 bis 10 in DMSO [bis 1 mM] und verdünnen Sie dann 1:5000 von 1 mM in das gewünschte Medium, um 0,2 μM Arbeitslösung zu erhalten
MEA Glasplatten	MultiChannel-Systeme	60MEA200/30iR-Ti-gr	Arbeitskonzentration 100x
Mehrkanal-Pipette P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofischer	21103049
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Thermofischer	11140050	Arbeitskonzentration 1x
Bleistift/Streptomycin	Thermofischer	15140122	Arbeitskonzentration 100x
Polyornithin (PLO)	Sigma-Aldrich	Nr. P3655	Arbeitskonzentration 100x
Kaliumchlorid (KCl)	Na	Na	Löse 100 mg in 1 mL ddW auf, um 100 mg/ml Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie den Stamm in 100 μL-Röhrchen. (Arbeitskonzentration 100 μg/ml)
Purmorphamin (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Arbeitskonzentration100 mM
ROCK-Hemmer	Peprotech	1293823	Vor der Rekonstitution kurz zentrifugieren. Löse 100 μg in 1 ml PBS auf 100 μg/ml auf und füge dann 9 ml steriles 0,1 % BSA-PBS zu 10 μg/ml hinzu. Aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1: 1000 verdünnen. (Arbeitskonzentration 10 ng/ml).
Sterile Zellkulturhauben	Bäcker-Unternehmen	SG-600	5 mg in 1480 μl dH2O auflösen, um 10 mM Stamm zu erhalten, aliquotieren und bei -80 ºC einfrieren. Zur Verwendung bei 1:500 verdünnen. (Arbeitskonzentration 20 μM).
Beilage B - B27 Beilage	Thermofischer	21985023
Tisch-Zellkulturzentrifuge	ThermoFisher	75004261	Arbeitskonzentration 50x
Thermoplastische Folie - Parafilm	PARAFILM	Nr. P7793	Sorvall Legend X1R
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Thermofischer	2530054	Arbeitskonzentration 1x
Wasserbad	ThermoFisher	Nr. 2332	Isotemp