Gleichzeitige Messung des intrazellulären Calcium- und Membranpotentials in einem zerebralen Endothel der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Hakim, M. A. et al. Gleichzeitige Messungen des intrazellulären Kalzium- und Membranpotentials in frisch isolierten und intakten zerebralen Endothelen von Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

Das Video zeigt die gleichzeitige Messung des intrazellulären Kalziumspiegels und der Veränderungen des Membranpotentials in Endothelzellen von Hirnarteriensegmenten von Mäusen. Die isolierte Endothelröhre wird mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator beladen und mit einem Medikament behandelt, das die intrazelluläre Kalziumfreisetzung induziert, was zu einer Änderung des Membranpotentials führt. Die Fluoreszenz des Indikators ermöglicht die Messung des Kalziumspiegels, und eine Aufzeichnungselektrode wird in eine Zelle eingeführt, um Änderungen des Membranpotentials zu messen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Dissektion und Isolierung der Hirnarterie

HINWEIS: Alle Präparierverfahren erfordern eine Probenvergrößerung (bis zu 50x) über Stereomikroskope und eine Beleuchtung durch faseroptische Lichtquellen. Um Dissektionsverfahren zur Isolierung des Gehirns und der Arterien durchzuführen, verwenden Sie geschärfte Dissektionsinstrumente. Zu den Mikrodissektionswerkzeugen zur Isolierung und Reinigung von Arterien gehören eine geschärfte Pinzette mit feiner Spitze und eine Präparierschere im Vannas-Stil (3 bis 9,5 mm Klingen).

1. Isolierung des Gehirns von Mäusen
   1. Eine C57BL/6-Maus (3-30 Monate alt; männlich oder weiblich) durch Inhalation von Isofluran (3% für 2-3 Minuten) anästhesieren und das Tier unmittelbar nach vollständiger Einleitung der Anästhesie enthaupten. Legen Sie den Kopf in eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Tiefe 1,5 cm) mit Kälte (4 °C) null Ca²⁺ Physiologische Salzlösung (PSS) unter einem Stereomikroskop.
   2. Entfernen Sie durch das Mikroskop die Haut und Haare über dem Schädel und entfernen Sie überschüssiges Blut mit kaltem Null Ca²⁺ PSS. Machen Sie einen Schnitt nur mit den Spitzen einer Standard-Präparierschere (z. B. 24-mm-Klinge), beginnend mit dem Hinterhauptbein und bis zum Nasenknochen des Schädels.
   3. Öffnen Sie den Schädel vorsichtig entlang des Schnitts mit einer groben Pinzette und trennen Sie das Bindegewebe, um das Gehirn mit einem intakten Willis-Zirkel zu isolieren.
      HINWEIS: Alternativ kann eine Littauer-Knochenschneidezange verwendet werden, um den Schädel zu öffnen und das Gehirn freizulegen.
   4. Waschen Sie das isolierte Gehirn vorsichtig mit kaltem Null Ca²⁺ PSS in einem Becherglas, um Blut zu entfernen. Legen Sie die ventrale Seite des Gehirns mit der Bauchseite nach oben in eine Kammer mit Kaltdissektionslösung, um die Hirnarterien zu isolieren (Abbildung 1A).
2. Isolierung der Hirnarterien
   HINWEIS: Die hintere Hirnarterie wurde als repräsentatives zerebrovaskuläres endotheliales Studienmodell für dieses Protokoll ausgewählt.
   1. Befestigen Sie das isolierte Gehirn in einer Kaltdissektionslösung mit Edelstahlstiften (Durchmesser 0,2 mm, Länge ~11–12 mm), die in ein mit Holzkohle angereichertes Silikonpolymer eingeführt werden, das den Boden (Tiefe ≥50 cm) einer Glas-Petrischale beschichtet.
   2. Um eine gekühlte PSS-Temperatur während der Dissektion aufrechtzuerhalten, verwenden Sie eine Sezierkammer, die durch ein Kältemittelsystem gekühlt wird, das kontinuierlich ein 1:1-Wasser-Ethylenglykol-Gemisch zirkelförmig zirkulieren lässt. Alternativ kann die Sektion auf frischem Eis durchgeführt werden.
   3. Isolieren Sie die hinteren Hirnarterien (~0,3 bis 0,5 cm Segmente, keine axiale Spannung) chirurgisch von der hinteren kommunizierenden und basilaren Arteria mit Mikrodissektionsinstrumenten, einer Vannas-Schere und einer geschärften Pinzette mit feiner Spitze (Abbildung 1B). Verwenden Sie Edelstahlstifte (Durchmesser 0,1 mm, Länge ~13–14 mm), um beide isolierten hinteren Hirnarterien in der Dissektionslösung in der Petrischale zu befestigen (Abbildung 1C).
   4. Reinigen Sie die isolierten hinteren Hirnarterien vorsichtig, indem Sie das Bindegewebe mit einer geschärften Pinzette mit feiner Spitze entfernen (Abbildung 1D). Intakte Arterien für die enzymatische Verdauung in Segmente (Länge 1–2 mm) schneiden (Abbildung 1D; Einschub).

>2. Vorbereitung der Endothelröhre und der Superfusion

1. Bereiten Sie die Verreibungsvorrichtung mit einem Mikroskop vor, das mit Objektiven (10x, 20x und 40x), einer Kamera und einem Aluminiumtisch ausgestattet ist, auf dem sich eine Kammer und Mikromanipulatoren befinden. Befestigen Sie eine Mikrospritze mit einer Pumpensteuerung neben dem Tisch und der Probe (Abbildung 2A).
2. Füllen Sie eine Verreibpipette vollständig mit Mineralöl zurück und befestigen Sie sie über dem Kolben der Mikrospritze. Ziehen Sie dann mit der Mikrospritze mit Pumpensteuerung die Dissoziationslösung in die Pipette (~130 nl) auf dem Mineralöl auf, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen in der Pipette vorhanden sind.
3. Legen Sie intakte arterielle Segmente in 1 ml Dissoziationslösung in ein 10-ml-Glasröhrchen (Abbildung 2B), das 0,31 mg/ml Papain, 0,5 mg/ml Dithioerythrit, 0,75 mg/ml Kollagenase und 0,13 mg/ml Elastase enthält. Bei 34 °C für 10–12 min inkubieren, um einen teilweisen Aufschluss zu erzielen.
4. Ersetzen Sie nach dem Aufschluss die Enzymlösung durch ~5 mL frische Dissoziationslösung. Übertragen Sie mit einer 1-ml-Pipette ein Segment in eine Kammer, die die Dissoziationslösung bei Raumtemperatur (RT) enthält.
5. Legen Sie die Pipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßes. Stellen Sie an der Pumpensteuerung eine Rate im Bereich von 2 bis 5 nL/s für eine sanfte Verreibung ein (Abbildung 2C; Einschub).
6. Während Sie durch eine 100- bis 200-fache Vergrößerung betrachten, ziehen Sie das arterielle Segment zurück und werfen es aus, um glatte Muskelzellen zu dissoziieren und gleichzeitig eine Endothelröhre zu erzeugen. Verwenden Sie bei Bedarf vorsichtig eine Pinzette mit feiner Spitze, um dissoziierte Adventitien und innere elastische Lamina von der Endothelröhre zu trennen. Bestätigen Sie, dass alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und dass nur Endothelzellen als intakte "Röhre" übrig bleiben (Abbildung 2C).
7. Befestigen Sie mit Mikromanipulatoren jedes Ende des Endothelrohrs mit Hilfe von Borosilikatglaspipetten auf dem Glasdeckglas der Superfusionskammer (Abbildung 2D).
8. Dessoziierte Adventitia- und glatte Muskelzellen aus der Kammer auswaschen und die Dissoziationslösung durch 2 mM CaCl₂ PSS ersetzen. Übertragen Sie die mobile Plattform mit dem gesicherten Endothelrohr auf das Mikroskop des Superfusions- und Experimentierpräparats.
9. Verwenden Sie 6 saubere 50-ml-Reservoire (Abbildung 3A) für die kontinuierliche Verabreichung von PSS und den entsprechenden Arzneimittellösungen während des Experiments. Verwenden Sie das Inline-Durchflussregelventil, um die Durchflussmenge manuell so einzustellen, dass sie mit der laminaren Strömung übereinstimmt, während die Durchflusszufuhr an die Vakuumabsaugung angepasst wird. Geben Sie PSS für ≥ 5 Minuten in die Kammer (Abbildung 3B) für die Superfusion des Endothelröhrchens, bevor Sie die Hintergrunddaten und die Farbstoffbeladung aufzeichnen.

>3. Einstellungen für Färbeladung, Auswaschen und Temperatur

1. Schalten Sie alle Komponenten des Photometriesystems für die Messung von [Ca²⁺]_i ein. Verwenden Sie das Mikroskop auf dem Versuchsstand (Abbildung 3C), um die Endothelröhre bei 400-facher Vergrößerung zu betrachten, und fokussieren Sie sich mit der Photometrie-Systemsoftware-Suite auf Zellen im photometrischen Fenster.
2. Messen Sie den Durchmesser der Endothelröhre und zeichnen Sie die Hintergrund-Autofluoreszenzwerte in Übereinstimmung mit der 510-nm-Emission während der Wechselanregung bei 340 und 380 nm (≥10 Hz) auf.
3. Um intrazelluläre Ca2⁺ ([Ca²⁺]_i)-Reaktionen zu messen, beladen Sie das Endothelrohr mit Fura-2 AM-Farbstoff (Fura-2-acetoxymethylester, 10 μM Endkonzentration) bei RT und lassen Sie ~30–40 min in Abwesenheit von Licht warten.
4. Starten Sie die Superfusion der Endothelröhre mit frischem PSS für ~30–40 Minuten, um überschüssigen Farbstoff auszuwaschen und intrazelluläres Fura-2 AM entestern zu lassen. Während der Auswaschphase wird die Temperatur mit dem Temperaturregler (Abbildung 3A) mit einer Inline-Heizung schrittweise von RT auf 37 °C erhöht und dann während des gesamten Versuchs bei 37 °C gehalten
   Anmerkung: Der empfohlene inkrementelle Übergang von RT auf 37 °C umfasst drei Schritte (z. B. 5 °C) mit einer Äquilibrierungszeit von ≥5 Minuten bei jedem Schritt.

>4. Gleichzeitige Messung von [Ca²⁺]_i und V_m

1. Schalten Sie alle anderen Geräte und die Elektrometer-Software-Suite zur Messung des Membranpotentials (V_m, siehe Abbildung 3, Abbildung 4) ein. Passen Sie die Datenerfassungsrate entsprechend an (≥10 Hz).
2. Ziehen Sie eine scharfe Elektrode und füllen Sie sie mit 2 M KCl. Für Untersuchungen der interzellulären Kopplung durch Farbstofftransfer füllen Sie die Mikroelektroden mit 0,1 % Propidiumiodid, gelöst in 2 M KCl, auf.
3. Befestigen Sie die Elektrode über einem mit Chlorid beschichteten Silberdraht in der Pipettenhalterung, die an einem Elektrometerkopftisch befestigt ist, der mit einem Mikromanipulator gesichert ist. Positionieren Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Elektrode kurz in das strömende PSS in der Kammer, während Sie durch das 4x-Objektiv schauen.
4. Stellen Sie den Ruhe-V_m auf 0 ein, da er mit dem geerdeten Badpotenzial übereinstimmt. Positionieren Sie die Elektrodenspitze knapp über einer Zelle der Endothelröhre. Falls gewünscht, können Sie akustische Basismonitore verwenden, die mit Elektrometern verbunden sind, um die Tonhöhe mit potenziellen Aufnahmen zu verknüpfen.
5. Erhöhen Sie die Vergrößerung mit dem 40-fachen Objektiv auf das 400-fache und positionieren Sie die Spitze der Elektrode nach Bedarf neu. Passen Sie das photometrische Fenster mit der Photometrie-Software an, um auf ~50 bis 80 Endothelzellen zu fokussieren.
6. Platzieren Sie die Elektrode vorsichtig mit dem Mikromanipulator in eine der Zellen des Endothelrohrs und warten Sie ≥2 Minuten, bis sich das ruhende_{V m} stabilisiert hat. Führen Sie auf ähnliche Weise eine zweite Elektrode in eine andere Zelle (Abstand ≥100 μm) von der ersten Zelle ein, die mit der ersten Elektrode aufgespießt wurde.
7. Sobald das ruhende V_m stabil bei seinen erwarteten Werten (-30 bis -40 mV) ist, schalten Sie das PMT an der Fluoreszenzgrenzfläche in Abwesenheit von Licht ein und beginnen Sie mit der Erfassung von intrazellulärem [Ca²⁺]_i, indem Sie Fura-2 abwechselnd (10 Hz) bei 340 und 380 nm anregen, während Sie die Fluoreszenzemission bei 510 nm sammeln.
   HINWEIS: Zur Prüfung der interzellulären elektrischen Kopplung kann Strom (± 0,5-3 nA, ~20 s Impulsdauer) über ein Elektrometer als "Site 1" abgegeben werden, und Änderungen von_{V m} können mit einem anderen Elektrometer als "Site 2" aufgezeichnet werden (Abstand ≥100 μm).
8. Sobald gleichzeitige Messungen von V_m und [Ca²⁺]_i etabliert sind, lassen Sie ~5 min für die Superfusion des Endothelrohrs mit PSS bei einer konstanten laminaren Flussrate warten, bevor Sie Medikamente applizieren.
9. Tragen Sie das in PSS hergestellte Arzneimittel (z. B. Adenosintriphosphat [ATP]) mit konstanter Durchflussrate in die Superfusionskammer auf. Nach ~3 min (oder einem für die Kinetik des Arzneimittels geeigneten Zeitraum) mit PSS waschen, bis V_m und das Verhältnis F₃₄₀/_{F 380} wieder auf ihren Ausgangszustand zurückkehren. Markieren Sie die jeweiligen Aufzeichnungen bei jedem Lösungswechsel über die Photometer- und Elektrometer-Software-Suiten hinweg als zeitlich synchronisiert.
10. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, ziehen Sie die Elektrode mit dem Mikromanipulator aus der Zelle heraus und beachten Sie V_m ~0 mV, wie von der Badelektrode referenziert. Stoppen Sie die entsprechenden Aufzeichnungen von V_m und [Ca²⁺]_i und speichern Sie die Aufzeichnungen zur Datenanalyse.

Ergebnisse

Abbildung 1: Isolierung der Hirnarterie vom Gehirn. (A) Gehirn isoliert mit intakten Arterien (weißer Pfeil zeigt die hintere Hirnarterie) in Dessektionslösung. (B) Vergrößerte Ansicht der hinteren Hirnarterie (weißer Pfeil; ~3x vs.Tafel A). (C) Isolierte hintere Hirnarterien, die mit Edelstahlstiften in der Probenschale gesichert sind. (...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Traubenzucker	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	Nr. G7021
NaCl	Sigma	Nr. S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	Nr. H4034
Kcl	Sigma	Nr. P9541
NaOH	Sigma	Nr. S8045
Atp	Sigma	Nr. A2383
hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Kollagenase (Typ H Mischung)	Sigma	Nr. C8051
Dithioerythrit	Sigma	Nr. D8255
Papain	Sigma	Nr. P4762
Elastase	Sigma	Nr. E7885
Bsa	Sigma	Nr. A7906
Propidiumiodid	Sigma	Nr. P4170
Dmso	Sigma	Nr. D8418
Fura-2 AM Farbstoff	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	Nr. F14185
Umlaufkühler (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Superfusionskammer aus Plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glasdeckglas Boden (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Plattform aus eloxiertem Aluminium (Durchmesser: 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 oder PH6
Kompakter Aluminiumtisch	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Mikromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomikroskope	Zeiss, NY, Vereinigte Staaten von Amerika	Stemi 2000 & 2000-C
Faseroptische Lichtquellen	Schott, Mainz, Deutschland & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon Inverses Mikroskop	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phasenkontrast-Objektive	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X und 20X)
Fluoreszierende Objektive	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) und 40X (Plan Fluor)
Nikon Inverses Mikroskop	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Steuerung der Mikrospritzenpumpe (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Tisch zur Schwingungsisolierung	Technische Fertigung, Peabody, MA, USA	Mikro-g
Verstärker	Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Schwerpunkte	Molekulare Bauelemente	HS-2A und HS-9A
Funktionsgenerator	EZ Digital, Seoul, Südkorea	FG-8002
System zur Datenerfassung	Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA	Digidata 1550A
Akustische Baseline-Monitore	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digitales Speicheroszilloskop	Tektronix, Beaverton, Oregon, Vereinigte Staaten von Amerika	TDS 2024B
Fluoreszenz-Systemschnittstelle, ARC Lampe + Netzteil, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA	IonOptix-Systeme
Temperaturregler	Warner Instruments	TC-344B oder C
Inline-Heizung	Warner Instruments	SH- 27B
Ventil-Regler	Warner Instruments	VC-6
Inline-Durchflussregelventil	Warner Instruments	FR-50
Elektronischer Abzieher	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 oder P-1000
Mikroschmiede	Narishige, East Meadow, NY, Vereinigte Staaten von Amerika	MF-900
Borosilikatglasröhren (Verreibung)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	Nr. 1B100-4
Borosilikatglasröhren (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilikatglasröhren (scharfe Elektroden)	Warner Instruments	GC100F-10
Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm)	ThermoFisher Scientific	Tel.: 722-2520
Petrischale aus Glas + Holzkohle Sylgard	Instrumentierung lebender Systeme, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Schere (3 mm & 9,5 mm)	Welt Präzisionsinstrumente	555640S, 14364
Schere 3 & 7 mm Klingen	Fine Science Tools (oder FST), Foster City, Kalifornien, USA	Moria MC52 & 15000-00
Geschärfte Pinzette mit feiner Spitze	FST	Dumont #5 & Dumont #55