Beurteilung der Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultur mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen

Zusammenfassung

Quelle: Su, C. T. E., et al. Ein optogenetischer Ansatz zur Beurteilung der Bildung neuronaler Verbindungen in einem Co-Kultursystem. J. Vis. Exp. (2015)

Das Video demonstriert elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Beurteilung neuronaler Verbindungen zwischen iPSC-abgeleiteten und kortikalen Neuronen der Ratte, zur Bestätigung synaptischer Kontakte in der Co-Kultur durch Aktivierung lichtempfindlicher Ionenkanäle und Detektion postsynaptischer Ströme.

Protokoll

>1. Elektrophysiologische Aufzeichnungen von iPSC-abgeleiteten Neuronen

1. Bestätigen, ob sich menschliche iPSCs wie reife Neuronen verhalten.
   1. Finden Sie Zellen, die sich von menschlichen iPS-Zellen unterscheiden, indem Sie tdTomato mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop visualisieren, das mit einer 60-fachen (0,9 NA) Wasserimmersionslinse ausgestattet ist.
   2. Die Aufzeichnungspipette auf einen Widerstand von 4 bis 6 M ziehen. Perfundierte Zellen bei Raumtemperatur in einer externen Lösung, die ständig mit 95 % O₂ / 5 % CO₂ gefüllt ist. Füllen Sie die Aufzeichnungsmikropipette mit der internen Lösung.
   3. Patchen Sie die tdTomato+-Zelle im Ganzzellmodus und zeichnen Sie das Auslösen des Aktionspotentials als Reaktion auf die Strominjektion (1 Sekunde Dauer, 10 pA-Schritte) in der Stromklemme auf.
2. Bestätigen, ob das Aktionspotenzial von kortikalen Zellen, die ChR2 exprimieren, zuverlässig durch Lichtstimulation hervorgerufen wird.
   1. Finden Sie kortikale Zellen, die ChR2 exprimieren, durch Visualisierung von GFP unter einem konfokalen Mikroskop. Führen Sie eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung an kortikalen Zellen durch, indem Sie die Schritte 1.1.2 bis 1.1.3 befolgen.
   2. Prüfen Sie, ob das Aktionspotential durch Lichtbeleuchtung mit einer Quecksilberbogenlampe (100 W) zuverlässig hervorgerufen wird. Die Wellenlänge des Anregungsfilters beträgt 480/40 nm.
3. Führen Sie eine optogenetische Stimulation durch.
   1. Patchen Sie die tdTomato+-Zelle im Ganzzellenmodus und stellen Sie die Spannungsklemme auf -70 mV ein. Filtern Sie Stromsignale bei 2 kHz und digitalisieren Sie bei 10 kHz. Überwachen Sie Serienwiderstände von 10 bis 20 M, um die Konsistenz während der Aufnahmen zu gewährleisten.
   2. Stimulieren Sie das gesamte Feld mit einer 100 W Quecksilberlampe mit einem 480/40 nm Anregungsfilter für 30 Sekunden.
   3. Aufzeichnung postsynaptischer Ströme (PSCs) von gepflasterten Zellen, die durch Photostimulation von ChR2-exprimierenden präsynaptischen kortikalen Neuronen induziert werden. Erkennen und Messen von PSCs.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaCl	Sigma	Nr. S7653
Kcl	Sigma	Nr. P5405
NaHCO3	Sigma	Nr. S5761
NaH2PO4	Fluka	Artikel-Nr.: 71505
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	Nr. C1016
D(+)-Glukose	Sigma	Nr. G7520	Für elektrophysiologische Untersuchungen
K-Gluconat	Sigma	Nr. P1847
Koh	KANTO Chemie	Artikel-Nr.: 3234400
HEPES	Sigma	Nr. H3375	Für elektrophysiologische Untersuchungen
EGTA (EGTA)	Sigma	Nr. E3889
Na2ATP	Sigma	Nr. A7699
Na3GTP	Sigma	Nr. G8877
Kapillaren aus Borosilikatglas	World precision instruments, Inc	1604323
Quecksilber-Kurzbogenlampe	OSRAM	HBO 103 mit 2