Bildgebung der Nikotin-induzierten Kalzium-Signalübertragung entlang ventraler Hippocampus-Axone in synaptischen Co-Kulturen

Zusammenfassung

Quelle: Zhong, C., et al., Live-Bildgebung der Nikotin-induzierten Kalzium-Signalgebung und der Neurotransmitterfreisetzung entlang ventraler Hippocampus-Axone. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt, wie die nikotinvermittelte Aktivierung von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren im ventralen Hippocampus der Maus zu einer anhaltenden Kalziumsignalisierung entlang der Axone führt.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Calcium-Bildgebung

1. Spülen Sie die Kulturen (5 - 7 Tage in vitro) schnell mit normalem HBS und beladen Sie die Kulturen dann 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO₂ mit 5 μM Fluo-4 Ca²⁺ Indikator (AM-Ester) und 0,02 % Pluronic F-127 in HBS (2 ml).
2. Waschen Sie die Fluo-4-Lösung mit HBS aus (3 Mal/5 Minuten). Stellen Sie die Kulturen für mindestens 30 min in den Inkubator (37 °C / 5 % CO₂).
3. Bewahren Sie die Kulturen (5 - 7 Tage in vitro) in einer Bildgebungskammer auf und montieren Sie die Kammer an einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop. Kontinuierliche Perfusion (1 ml/min) mit HBS-Cocktail bei RT.
4. Sammeln Sie Fluo-4-Fluoreszenzbilder von axonalen Projektionen aus den vHipp-Mikroschnitten mit einem Plan-Apochromat-Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und einer CCD-Kamera.
5. Sammeln Sie Fluo-4-Fluoreszenzbilder zu Studienbeginn (alle 10 Sekunden für 2 Minuten) als Prä-Nikotinkontrolle. Tragen Sie Nikotin (1 μM) durch schnelle Perfusion (2 ml/min) für 1 min auf und waschen Sie das Nikotin dann mit einem HBS-Cocktail. Nehmen Sie vor, während und nach der Nikotinanwendung alle 10 Sekunden 30 Minuten lang Zeitrafferbilder auf.
6. Speichern Sie alle Frames der rohen Fluo-4-Fluoreszenzbilder und exportieren Sie sie als eine Reihe von TIFF-Bildern zur weiteren Analyse.
7. Erfassen Sie die integrierte Intensität der Fluo-4-Fluoreszenz entlang der vHipp-Axone vor und nach der Nikotinanwendung.
8. Normalisieren Sie die integrierte Fluoreszenzintensität mit der folgenden Gleichung: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, wobei F₀ die hintergrundkorrigierte integrierte Fluoreszenzintensität vor dem Nikotin und F die integrierte Fluoreszenzintensität entlang der vHipp-Axone zu jedem Zeitpunkt nach der Nikotinapplikation ist. Analysieren und plotten Sie die normierte integrierte Fluoreszenzintensität.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HBS-Cocktail für Live-Bildgebung pH=7,3
NaCl	Sigma	Nr. S9888	ca. 135 mM
Kcl	Sigma	Nr. 9333	5 mM
Magnesiumchlorid	Sigma	M8266	1 mM
Calciumchlorid	Sigma	Nr. C1016	ca. 2 mM
HEPES	Sigma	Nr. H3375	ca. 10 mM
Traubenzucker	Sigma	G0350500	ca. 10 mM
Tetrodotoxin	Tocris	Nr. 1078	2 μM
Bicuculline	Tocris	Nr. 131	10 μM
D-AP-5	Tocris	Nr. 105	50 μM
CNQX	Tocris	Nr. 1045	20 μM
LY341495	Tocris	Nr. 1209	10 μM