Testen der sensorischen Nervenfunktion in einem operativ denervierten Mausmodell

Abstract

Quelle: Peterson, S. C. et al., Kutane chirurgische Denervierung: Eine Methode zum Testen des Bedarfs an Nerven in Mausmodellen für Hauterkrankungen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert das Testen der sensorischen Nervenfunktion in einem Mausmodell, indem eine Seite chirurgisch denerviert und die andere als Kontrolle belassen wird. Die Reaktion auf mechanische Stimulation bestätigt die Rolle der sensorischen Nerven.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Chirurgische Denervierung

1. Injizieren Sie die Anästhesielösung intraperitoneal in einer Dosis von 200 μl pro 20 g Körpergewicht der Maus. Vergewissern Sie sich, dass das Tier die richtige Sedierungsstufe erreicht hat, indem Sie den Zehenquetschtest durchführen, und vergewissern Sie sich, dass die Herzfrequenz und die Atemfrequenz normal sind (ca. 600 Schläge bzw. 160 Atemzüge pro Minute).
2. Bereiten Sie den Operationsbereich der Rückenhaut mit Betadin- und Alkoholtüchern vor und decken Sie das Tier mit einem sterilen OP-Tuch ab (zu Demonstrationszwecken wurde auf ein steriles Tuch verzichtet, um die Sichtbarkeit zu erhöhen). Halten Sie das Tier mit einem Heizkissen warm, während Sie in einem aseptischen Operationsbereich operieren.
3. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell #11 einen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie von der Basis des Halses bis etwa 0,5 cm über dem Schwanz.
4. Reflektieren Sie mit einer stumpfen Pinzette die Haut auf der linken Seite sanft von der Flanke weg, um das darunter liegende Gewebe von den Schulterblatt-Fettpolstern in der Nähe des Halses bis knapp über die hintere Gliedmaße sichtbar zu machen.
   Anmerkung: Die dorsalen Hautnerven erscheinen als weiße Stränge, die kaudal durch die durchscheinende Faszie der Rumpfwand verlaufen, bevor sie scharfe Biegungen machen und in das lockere Bindegewebe unter der Haut eindringen (Abbildung 1).
5. Mit einer ultrafeinen Pinzette unter einem Präparierlichtmikroskop werden die Nerven ausschließlich von der linken Seite des Tieres entfernt, die sich an den anatomischen Stellen T3-12 befinden, indem man von der Stelle, an der sich die Segmente an der Rumpfwand biegen, bis zu ihren Eintrittsstellen in die Haut zupft (Abbildung 1).
   1. Richten Sie die Pinzette vertikal aus und entfernen Sie die Nerven, indem Sie etwa 0,5 cm unterhalb ihrer Biegestellen greifen und nach oben ziehen, wodurch sich der Nerv dehnt und vom umgebenden Gewebe trennt (Abbildung 1C-E). Achten Sie darauf, dass benachbarte Blutgefäße nicht reißen.
   2. Fahren Sie fort, bis alle Nerven, die sich von der Rumpfwand bis zur Haut erstrecken, entfernt sind. Stören Sie nicht die Nerven in der dichten Faszie der Rumpfwand. Halten Sie das Gewebe während des gesamten Eingriffs feucht, indem Sie regelmäßig Tropfen steriler 0,9%iger Kochsalzlösung auftragen.
   3. Alternativ können Sie Nerven entfernen, indem Sie ihre proximalen Enden in der Nähe der Rumpfwand mit einer Zange greifen und mit einer feinen Schere abschneiden. Anschließend werden die distalen Enden in der Nähe der Haut durchtrennt (Abbildungen 1F-H). Entfernen Sie abschließend die dazwischenliegenden Nervensegmente (Abbildung 1I).
6. Entfernen Sie alle Nerven aus dem Hautlappen, der in Schritt 1.4 freigelegt wurde. Diese Fasern bestehen aus den distalen Ästen der dorsalen Hautnerven und erscheinen als weiße, verzweigte Stränge, die sporadisch im Bindegewebe auf der dermalen Seite des Hautlappens angeordnet sind (Abbildungen 1J-K).
   1. Um diese feinen Äste zu entfernen, positionieren Sie die feine Pinzette ungefähr parallel zur Hautoberfläche, fassen Sie die Nerven und zupfen Sie sie nach oben, um Blutgefäße nicht zu stören und die Haut nicht zu durchstechen. Fahren Sie fort, bis alle sichtbaren Nerven entfernt sind.
7. Reflektieren Sie bei stumpfer Dissektion die Haut auf der rechten Seite des dorsalen Mittellinienschnitts, entfernen Sie jedoch nicht die Nerven. Dies dient als kontralaterale scheinbetriebene Kontrolle.
8. Naht entlang der dorsalen Mittellinie in einem einfachen unterbrochenen Muster, um den Schnitt mit 6-0-Nylon-Nähten in einem einfachen unterbrochenen Muster im Abstand von etwa 3 mm zu schließen.
9. Setzen Sie Mäuse, die operiert wurden, erst nach vollständiger Genesung in denselben Käfig wie andere Tiere ein.
10. Überwachen Sie die Tiere unmittelbar nach der Operation, bis sie das Bewusstsein wiedererlangen, und auch täglich, bis das Operationsgebiet verheilt ist, in der Regel innerhalb von 1 Woche. Verwenden Sie Analgetika in Übereinstimmung mit den ausgewiesenen institutionellen Tierhaltungs- und Anwendungsrichtlinien, wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zeigen. Entfernen Sie die Nähte innerhalb von 7-10 Tagen nach der Operation. Anmerkung: Falls erforderlich, bereiten Sie die analgetische Lösung her, indem Sie Carprofen (50 mg/ml Stammlösung) 1:100 in sterilem Wasser verdünnen. Injizieren Sie die Lösung subkutan zwischen die Schulterblätter in der Nähe des Nackens in einer Dosis von 200 μl pro 20 g Körpergewicht (5 mg/kg Körpergewicht der Maus).
11. Um eine stabile Denervierung bis zu mehreren Wochen nach der Operation funktionell beurteilen zu können, entfernen Sie die Haare mit einer elektrischen Haarschneidemaschine von der Rückenhaut.
12. Stechen Sie vorsichtig mit einer Injektionsnadel in die denervierte Hautpartie und achten Sie darauf, ob das Tier reagiert, typischerweise durch Zittern oder Drehen des Kopfes. Wenn die Hautstelle stabil ennerviert wurde, zeigt das Tier keine oder nur eine geringe Reaktion.

Results

Abbildung 1. Zwei Ansätze zur Denervation der Rückenhaut. (A) Karikaturdiagramm der Haut einer innervierten Maus. Rot gestrichelte Linien zeigen eine einmalige Exzision entlang der dorsalen Mittellinie, um die darunter liegende Muskulatur an der Rumpfwand (violett) sowie die Dermis (grau, Sternchen) unter der reflektierten Haut freizulegen. Dorsale kutane Nerven, die kaudal verlaufen, scheinen ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkohol-Vorbereitungspads	Pdi	Nr. B339
AnaSed (Xylazin)	Lloyd	NADA 139-236
Betadin-Vorbereitungspads	Medline	MDS093917
Carprofen (Rimadyl)	Zoetis
Akku-Haarschneidemaschine	Wahl	Trimmer Modell 8900
6-0 Nylon-Nähte	DemeTECH	NL166012F4P
Ultrafeine Pinzette	Dumont	0103-5-PO