Untersuchung des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) in Drosophila-Photorezeptoren

Zusammenfassung

Quelle: Gutorov, R., et al. Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentspiegels in Drosophila-Photorezeptoren. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt ein experimentelles Protokoll zur Untersuchung des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) bei weißäugigen Drosophila. Das Auge der Fliege wird intensiven blauen Lichtimpulsen ausgesetzt, um das Photopigment Rhodopsin in Metarhodopsin umzuwandeln, wodurch eine Signalkaskade in Gang gesetzt wird, die positive Ionenkanäle öffnet und eine Membrandepolarisation verursacht. Da blaues Licht die Rückumwandlung von Metarhodopsin in Rhodopsin verhindert, führt der kontinuierliche Zustrom positiver Ionen zu einer anhaltenden Depolarisation, die als verlängertes depolarisierendes Nachpotential (PDA) bekannt ist.

Protokoll

>1. Messung des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) mit Hilfe des Elektroretinogramms

1. Geeignete Aufzuchtbedingungen für die Vorbereitung von Drosophila melanogaster
   1. Raise D. melanogaster fliegt in Flaschen mit normalem gelbem Mais, der Futter enthält, in einem Inkubator, der bei einer Temperatur von 24 °C und in einem 12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus gehalten wird.
   2. Bewahren Sie die Fliegenflaschen mindestens 24 Stunden vor dem Versuch im Dunkeln auf.
2. Allgemeine Einrichtung
   1. Bereiten Sie die Aufzeichnungspipetten vor, indem Sie 1 mm x 0,58 mm (AD x ID) fasergefüllte Borosilikatglaskapillaren ziehen (Abbildung 1L, O). Der Widerstand der Pipetten sollte 5-10 MΩ betragen; Es kann jeder geeignete Abzieher verwendet werden.
   2. Beschichten Sie zwei Silberdrähte mit AgCl₂ und führen Sie 0,25 mm Silberdraht in eine 3 M KCl-Lösung ein, die an ein speziell angefertigtes 5-V-Netzteil angeschlossen ist.
   3. Führen Sie jeden beschichteten Silberdraht in die Elektrodenhalter ein (Abbildung 1N).
   4. Füllen Sie die Glaskapillare mit filtrierter Ringer-Lösung (siehe Tabelle 1) mit einer Spritze mit länglicher Spitze (Abbildung 1M).
   5. Führen Sie die Drahtelektrode in die Glaskapillare ein. Stellen Sie sicher, dass die Lösung in der Kapillare mit dem Silberdraht in Kontakt kommt.
   6. Setzen Sie die Elektrodenhalter (Abbildung 2P, N) in die beiden Elektroden-Mikromanipulatoren ein (Abbildung 2G).
3. Verfahren zur Vorbereitung der Fliege für elektrische Aufzeichnungen
   HINWEIS: Um die Fliege unter dunkelheitsangepassten Bedingungen zu halten, verwenden Sie während der folgenden Schritte nur schwache rote Lichtbeleuchtung.
   1. Betäuben Sie die Fliegen in der Flasche mit CO₂ -Gas mit dem Fliegenschläfersystem (Abbildung 1A, B) und gießen Sie sie in den Schläferbehälter.
   2. Wähle eine Fliege aus und halte sie vorsichtig mit einer scharfen Pinzette am Flügel fest. Decken Sie den Rest der Fliegen mit einer Petrischale ab.
   3. Legen Sie die Fliege in der richtigen Ausrichtung auf den Fliegenhalter – auf der Seite liegend, mit dem Rücken zur Hand (Abbildung 1P).
   4. Schalten Sie die Stromversorgung des Lötkolbens ein. Stellen Sie den Strom auf ~2,25 A ein. Dieser Strom sollte das 0,25 mm Platin-Iridium-Filament auf ~55-56 °C erhitzen.
   5. Geben Sie einen Tropfen Wachs mit einer niedrigen Schmelztemperatur (~55-56 °C) auf den Lötkolben (Abbildung 1F).
   6. Heben Sie die Fliege mit einer Pinzette von ihren Flügeln und befestigen Sie ihre Flügel mit dem Lötkolben am Fliegenhalter (Abbildung 1I).
   7. Verbinden Sie mit dem Lötkolben die Rückseite der Fliege mit Wachs mit der Ständeroberfläche (Abbildung 1P).
   8. Senken Sie die Spitze des Lötkolbens auf den Verbindungspunkt der Beine und schmelzen Sie das Wachs, um alle Beine zusammen zu bedecken (Abbildung 1P).
   9. Platzieren Sie einen kleinen Tropfen Wachs zwischen Kopf und Rücken im Nackenbereich (Abbildung 1P).
      HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, dass der Fliegenkopf nicht überhitzt wird. Stellen Sie sicher, dass die Fliege ordnungsgemäß befestigt ist und sich während des Versuchs nicht bewegen kann. Kleinere Bewegungen können zu Artefakten in den Aufnahmen führen. Achten Sie darauf, dass die Luftröhrenöffnungen (Atemeinlässe) im Brustkorb und Bauch nicht mit Wachs bedeckt sind.
   10. Platzieren Sie den Fliegenhalter (Abbildung 2Q) in einem dunklen Faradayschen Käfig auf einem Magnetblock (Abbildung 2I) und stellen Sie sicher, dass die Fliege ~5 mm vom Ende des Lichtleiters entfernt ist (Abbildung 2L).
   11. Platzieren Sie die Aufzeichnungselektrode (Abbildung 2P) mit den Mikromanipulatoren über dem Auge der Fliege und die Erdungselektrode (Abbildung 2N) über dem oberen Rücken der Fliege.
   12. Führen Sie die Masseelektrode mit den Mikromanipulatoren in die Rückseite der Fliege ein.
   13. Die Aufzeichnungselektrode wird vorzugsweise mit Hilfe von Mikromanipulatoren in den äußeren Umfang des Fliegenauges eingeführt.
       Anmerkung: Nach dem Einführen der Elektrode in das Auge wird ein kleines Grübchen beobachtet; Ziehen Sie die Elektrode nach oben, ohne sie aus dem Auge zu nehmen, bis das Grübchen verschwindet. Die Elektroden können auch in kleine Tröpfchen Elektrodengelee getaucht werden, die auf den Rumpf und das Auge aufgetragen werden.
4. PDA-Protokoll (dieses Protokoll kann nur bei Weißaugenfliegen durchgeführt werden)
   1. Geben Sie einen Lichtimpuls von 5 s maximaler Intensität mit einem Orangefilter (590 Kantenfilter, um das maximale Photopigment in den R-Zustand umzuwandeln).
   2. Ersetzen Sie den orangefarbenen Filter durch einen Breitband-Blaufilter (BP450/40 nm) und geben Sie drei Lichtimpulse von 5 s bei maximaler Intensität ab.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, einen langen kontinuierlichen blauen Lichtimpuls mit maximaler Intensität abzugeben, bis eine stationäre Spannungsantwort erreicht ist.
   3. Warten Sie 60 s im Dunkeln, ersetzen Sie den Blaufilter durch den vorherigen orangefarbenen Filter und geben Sie zwei 5 s Lichtimpulse im Abstand von 60 s.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Ringer-Lösung

Die Lösung von Ringer
Reagenz	Konzentration (mM)
NaCl	Nr. 130
Kcl	arabische Ziffer
MgCl2	5
CaCl2	arabische Ziffer
HEPES	10
pH-Titration auf 7,15 mit NaOH und HCl

Ergebnisse

Abbildung 1: Werkzeuge und Geräte, die für die Fliegenfixierung und die Aufzeichnung der Pipettenvorbereitung benötigt werden. (A) Fly-Sleeper-System; (B) Pedal des Fly-Sleeper-Systems; (C) Kaltlichtquelle; (D) Stereoskopisches Mikroskop; (E) Wachs-Glühfaden-Erhitzer; (F) Lötkolben; (G) Wachs-Filament-Heizpedal; (H) Raue Pinzette; (I) Magnetischer Fliegenständer; (J) Wachs bei niedriger Schmelztem...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Spritze mit länglicher Spitze			Abbildung 1M
1 grobe Pinzette		Dumont #5, Standard	0,1 mm x 0,06 mm, Länge 110 mm, Edelstahl (Abbildung 1H)
2 Kondensorlinsen
A/D-Wandler	Molekulares Gerät	Digidata 1200	Möglicher Ersatz: beliebige Digidaten von molekularen Bauelementen (z. B. 1440A) - Abbildung 2C
Verstärker	Nahezu perfekte Elektronik		Möglicher Ersatz: Warner-Instrumente - IE251A oder IE-210 (mit Kopftisch) - Abbildung 2D
Anti-Vibrations-Tisch	Newport	VW-3036-OPT-01	Abbildung 7H
kapillaren	Harvard-Apparatur	Kapillaren aus Borosilikatglas	1 mm x 0,58 mm (Abbildung 1O)
Clampex	Molekulares Gerät		Software
CO2-Tank
Kaltlichtquelle	Schott	KL1500 LCD	Abbildung 1C
Empfindliche Scheibenwischer	Kimtech		Kimwipes (Abbildung 1K)
Elektrodenhalter			Geeignet für Kapillar-AD 1 mm (Abbildung 1N, Abbildung 2N und Abbildung 2P)
Faradayscher Käfig	Hausgemacht		Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen und schwarzer Frontvorhang (Abbildung 2K)
Filter (Farbe)	Schott	OG590, Kantenfilter	Abbildung 2S
Filter (Farbe)	Schott	BP450/40 nm	Abbildung 2S
Filter (Farbe)	Klubjacken	550 nm	Abbildung 2S
Filter (Farbe) für Kaltlichtquelle	Schott	RG630	Abbildung 1C
Filter (Hitze)	Schott	KG3	Abbildung 1S
Filter (Grauraumfilter)	chroma	6,5,4,3,2,1,0,5,0,3	Abbildung 2S
Blitzlampen-System	Honeywell		Abbildung 2U
Fly-Sleeper-System mit Injektor	Einspritzen + matic		Abbildung 1A-B
Stromversorgung der Lampe	Pti	LPS-220	Abbildung 2W
Lichtdetektor	Hausgemacht		Fototransistor (Abbildung 2O)
Lichtleiter			3 mm Durchmesser, 1,3 m lang (Abbildung 2L,M)
Lichtquelle			Ozonfreie Hochdruck-Xenonlampe mit 75 W (Betrieb mit 50 W), möglicher Austausch: Cairn research- OptoLED (Abbildung 7R)
Schmelzwachs bei niedrigen Temperaturen	Hausgemacht		Bestehend aus einer Mischung aus Bienenwachs (Tm≈62 °C) und Paraffin bei ~3:1, um eine Schmelztemperatur von ~55 – 56 °C zu erreichen (Abbildung 6J)
Magnetischer Ständer für Fliegen	Hausgemacht		Abbildung 1I und Abbildung 2Q
Mikroelektroden-Vorverstärkersystem mit Kopftisch	Nahezu perfekte Elektronik		Impedanztester (Abbildung 2G)
Mikromanipulator (mechanisch grob)	Tritech Research, Narishige	M-2
Mikromanipulator (mechanisch fein)	Leitz Mikrosysteme	Leitz Mechanischer Mikromanipulator	Abbildung 2F
pCLAMP	Molekulares Gerät		Software
Petrischale			60 mm
Impulsgeber	AMPI	Meister 8	Abbildung 2A
Redux Creme für die Elektrokardiographie	Parker Laboratorien	Redux Elektrolyte Creme
Treiber für den Verschluss	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Einkanal Uni-stabil	Abbildung 2V
Rollladen-System	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stabile Fensterläden	Abbildung 2V
Silberdraht	Warner Instruments		Durchmesser 0,25–1 mm, muss chloridisiert werden
Lötkolben aus einem Platin-Iridium-Filament			0,25 mm Durchmesser (Abbildung 2F)
Stereoskopisches Zoom-Mikroskop	Nikon	SMZ-2B	Abbildung 1D
Stereoskopisches Zoom-Mikroskop	wild	Wild M5	Mit 6, 12, 25 und 50 Vergrößerungsstufen (Abbildung 2E)
Spritzenvorsatz-Filter	Millex		22 μm PVDF-Filter
Vertikaler Pipettenabzieher	Sutter/ Narishige	Modell P-97/PP-830	Verwenden Sie je nach Wahl einen vertikalen oder einen horizontalen Abzieher (Abbildung 1L)
Wachs-Filament-Erhitzer	Hausgemacht		Abbildung 1E-G
Xenon-Blitzlampensystem	Dr. Rapp OptoElektronik	JML-C2	Abbildung 2X