Visualisierung und Kartierung neuronaler Signalwege in einem Amygdala-Hirnschnitt

Zusammenfassung

Quelle: Bosch, D., et al. Ex vivo Optogenetische Dissektion von Angstschaltkreisen in Gehirnschnitten. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Analyse der synaptischen Konnektivität zwischen dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Amygdala-Neuronen anhand von akuten Amygdala-Hirnschnitten von Mäusen. Die mPFC-Neuronen in diesen Mäusen exprimieren Channelrhodopsin, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Die Kanalrhodopsine erleichtern den Ioneneinstrom und die Generierung von Aktionspotentialen in den mPFC-Neuronen nach Lichtaktivierung. Folglich setzen mPFC-Neuronen Neurotransmitter frei, die an postsynaptische Amygdala-Neuronen binden und postsynaptische Ströme auslösen, die aufgezeichnet werden, um die mPFC-Amygdala-Konnektivität sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Visualisierung und Stimulation präsynaptischer Fasern

1. Patch-Mikroskop für die optogenetische Aktivierung von Fasern und Zellen vorbereiten:
   1. Zentrieren Sie die montierte Leuchtdiode (LED) auf dem Lichtabgabeweg.
   2. Messen Sie die LED-Lichtintensität in der hinteren Brennebene und am Ausgang jedes Objektivs mit einem Leistungsmesser, das die geeignete Wellenlänge von 470 nm wählt.
   3. Berechnen Sie die Lichtintensität in mW/mm² und erstellen Sie für jedes Objektiv eine Kalibrierkurve (LED-Intensität (%) versus Lichtleistung (mW/mm²)) für Werte, die für eine Wellenlänge von 470 nm gemessen wurden.
2. Entnehmen Sie eine akute Amygdalascheibe aus der Grenzflächenkammer und legen Sie sie in die Schnittkammer, die auf dem aufrechten Mikroskop montiert ist, das mit einer Leuchtstofflampe ausgestattet ist. Achten Sie darauf, die Scheibe so zu positionieren, dass die Schichtoberfläche in der Interface-Kammer auch in der Aufnahmekammer nach oben zeigt. Perfundierte Scheibe mit frischer, sauerstoffhaltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) in einer Geschwindigkeit von 1 - 2 ml/min bei einer Temperatur von ~31 °C.
3. Beobachten Sie präsynaptische Fasern in der Scheibe unter Verwendung der Leuchtstofflampe in Kombination mit geeigneten Filtersätzen für das spezifisch exprimierte Fluoreszenzprotein. Verwenden Sie ein 5-fach-Objektiv, um einen Überblick zu erhalten (Abbildung 1E), und ein 60-fach-Objektiv zur Beurteilung der Faserdichte innerhalb des Zielbereichs.
   Hinweis: Für GFP und YFP ist das Filterset "grün" (Anregung 472/20, Strahlteiler 495, Emission 490 LP) für mCherry das Filterset "rot" (Anregung 560/40, Strahlteiler 585, Emission 630/70) wie in der Material-/Gerätetabelle angegeben zu verwenden.
4. Öffnen oder verengen Sie die Apertur im Lichtweg des Mikroskops wie für das Experiment gewünscht (Abbildung 2D).
5. Um eine Patch-Aufzeichnung zu erhalten, füllen Sie eine Patch-Pipette mit interner Lösung und montieren Sie sie in den Elektrodenhalter. Üben Sie Überdruck auf die Patch-Pipette aus und senken Sie sie langsam zuerst in die Badlösung und dann unter Sichtkontrolle mit dem Mikromanipulator in die Scheibe ab.
   1. Nähern Sie sich dem interessierenden Neuron mit der Patch-Pipette von der Seite und von oben. Lassen Sie den Überdruck ab, wenn sich die Pipette auf der Oberfläche der Zelle befindet (Grübchen auf der Zelloberfläche sichtbar) und erhalten Sie durch Anlegen von Unterdruck eine "Gigadichtung".
   2. Wenden Sie eine weitere Saugkraft an, um das Membranpflaster zu sprengen und eine Ganzzellaufzeichnung zu erhalten. Stimulieren Sie anschließend markierte Fasern mit der angeschlossenen LED unter Verwendung der entsprechenden Wellenlänge zur Aktivierung von Channelrhodopsin (ChR) (470 nm), während Sie die elektrischen Reaktionen der Zelle aufzeichnen.
   3. Für die synaptische Stimulation beginnen Sie mit einer niedrigen LED-Intensität und erhöhen Sie sie, bis die gewünschte synaptische Stromamplitude erreicht ist. Lösen Sie die LED aus, indem Sie die digitalen Ausgänge in der Datenerfassungssoftware konfigurieren, um das Timing und die Impulslänge zu steuern (Beispiele in Abbildung 3).
      Hinweis: Andere Software und/oder TTL-generierende Geräte können verwendet werden, um die LED auszulösen.
6. Wiederholen Sie die Stimulation mit geöffneter oder eingeschränkter Apertur (Schritt 1.4) im Lichtweg des Mikroskops, wie gewünscht für die nächste aufgezeichnete Zelle und/oder in Gegenwart spezifischer Medikamente.

Ergebnisse

Abbildung 1. Stereotaktische Injektionen, Präparation von akuten Hirnschnitten und Visualisierung präsynaptischer Fasern. (A, B) Stereotaktische Virusinjektion. A) Bild einer anästhesierten Maus, die in einen stereotaktischen Rahmen gelegt wurde, mit freiliegendem Schädel und der Injektionspipette. Einschub: Vergrößern Sie das Bild einer Injektionspipette, die mit Viruslösung gefü...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF)	Zur Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23
Interne Patch-Lösungen	Zur Zusammensetzung siehe Referenzen #16 und #23
MagnesiumSulfat-Heptahydrat	Roth, Deutschland	Nr. P027.1	2M-Stammlösung in gereinigtem Wasser zubereiten
Stereoskop, SZX2-RFA16	Olympus, Japan
Xcite Leuchtstofflampe (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Kanada	Artikel-Nr.: 2012-12699
Patch-Mikroskop, BX51WI	Olympus, Japan
Multiclamp 700B Patch-Verstärker	Molecular Devices, USA
Zifferndaten 1440A	Molecular Devices, USA
PClamp Software, Version 10	Molecular Devices, USA		Wird zur Steuerung der Datenerfassung und -stimulation verwendet
Temperaturregler für Bad, TC05	Luigs & Neumann, Deutschland	Tel.: 200-100 500 0145
Dreiachsiger Mikromanipulator Mini 25	Luigs & Neumann, Deutschland	210-100 000 0010
Steuerung für Mikromanipulator SM7	Luigs & Neumann, Deutschland	Tel.: 200-100 900 7311
Glaskapillaren für Patch-Pipetten	World Precision Instruments, Deutschland	GB150F-8P
Zellulosenitrat-Filterpapier für die Trennschichtkammer	Satorius Stedim Biotech, Deutschland	13006--50----ACN
LED-Einheit, CoolLED pE	CoolLED, Großbritannien	Nr. 244-1400	CoolLED oder USL 70/470 und entsprechende Adapter sind zwei alternative Optionen für die LED-Stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, Großbritannien	pE-ADAPTER-50E
LED-Einheit, USL 70/470	Rapp Optoelectronic	Nr. L70-000
Adapter mit zwei Anschlüssen	Rapp Optoelectronic	Erkundigen Sie sich bei der Firma
Filtersatz rot (Anregung)	AHF, Deutschland	Nr. F49-560	Filter können als Set F46-008 gekauft werden
(Strahlteiler)	AHF, Deutschland	Nr. F48-585
(Emission)	AHF, Deutschland	Nr. F47-630
Filterset grün (Anregung)	AHF, Deutschland	Nr. F39-472	Alternativen: Filterset F36-149 oder F46-002 (mit Bandpass-Emission)
(Strahlteiler)	AHF, Deutschland	F43-495W
(Emission)	AHF, Deutschland	Nr. F76-490
LaserCheck, tragbarer Leistungsmesser	Coherent, Vereinigte Staaten von Amerika	1098293
IgorPro Software, Version 6	Wavemetrics, USA		Für die elektrophysiologische Datenanalyse können auch andere alternative Softwarepakete verwendet werden
Neuromatische Makro-Suite für IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com