Aufnahme des Elektroretinogramms und des visuell evozierten Potentials bei einer Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Charng, J. et al. Implantation und Aufzeichnung des drahtlosen Elektroretinogramms und des visuell evozierten Potentials bei bewussten Ratten. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt, wie man das Elektroretinogramm (ERG) und das visuell evozierte Potenzial (VEP) bei einer bewussten Ratte aufzeichnet. Die Ratte wird zunächst mit chirurgisch implantierten Elektroden dunkeladaptiert. Nach dem Auftragen von dilatierenden Tropfen wird das Tier in eine Fesselung gelegt und in eine Ganzfeld-Schüssel gelegt. Anschließend werden die ERG- und VEP-Signale aufgezeichnet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Elektroden vorbereiten

Hinweis: Für die chirurgische Implantation wird ein dreikanaliger Sender verwendet, der es ermöglicht, 2 Elektroretinogramme (ERG) und 1 visuell evozierte Potentialaufzeichnung (VEP) gleichzeitig durchzuführen. Die drei aktiven und drei inaktiven Elektroden müssen vor der Implantation in eine Ringform vorgeformt werden, um sie am Auge zu befestigen. Zur Identifizierung hat der Hersteller aktive Elektroden in halbweißen, halbfarbigen Kunststoffhüllen eingeschlossen, während inaktive Elektroden mit vollfarbigen Hüllen überzogen sind. Die Masseelektrode (durchsichtiger Kunststoffmantel) wird für alle aktiven und inaktiven Elektroden unverändert gelassen, um die Schritte 1.1, 1.2, 1.3 und 1.7 durchzuführen.

1. Lösen Sie die doppelsträngige Edelstahlelektrode mit zwei Feinzangen.
2. Schneiden Sie einen der Edelstahlstränge ab (ca. 1 cm von der Spitze entfernt), wobei ein einzelner, längerer gerader Strang übrig bleibt, um die Ringelektrode zu formen.
3. Falten Sie den einzelnen Edelstahlstrang wieder auf sich selbst und drehen Sie ihn zu einem glatten Ring an der Spitze der Elektrode.
4. Für die aktiven ERG-Elektroden formen Sie diese Schleife mit einem Durchmesser von ~ 0,2 - 0,5 mm, indem Sie die Basis der Schleife verdrehen (für den hier beschriebenen Zweck formen Sie zwei aktive Elektroden so, dass ERG von beiden Augen aufgezeichnet wird), und für die inaktive ERG- und VEP-Elektroden machen Sie den Schleifendurchmesser ~ 0,8 mm Durchmesser (in diesem Beispiel tun Sie dies für eine aktive VEP-Elektrode und alle drei inaktiven Elektroden).
5. Hängen Sie die kreisförmige VEP-Aktivelektrode so um eine Edelstahlschraube (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm), dass die Elektrode am Schraubenkopf anliegt.
6. Haken Sie die 3 inaktiven Elektroden (2 ERG, 1 VEP) um eine zweite Edelstahlschraube (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm) ein.
7. Ziehen Sie die Kunststoffhülle über die scharfen Enden der beiden Edelstahlstränge nach vorne, um Irritationen zu vermeiden.
8. Sterilisieren Sie die Telemetriesender, indem Sie sie mehr als 10 Stunden lang bei ca. 25 °C in 2 % Glutaraldehyd einweichen. Spülen Sie dann den Transmitter dreimal mit steriler Kochsalzlösung aus.

>2. Sender-Implantation

1. Zubereitung von Tieren
   1. Desinfizieren Sie den Operationsbereich vor dem Experimentieren, indem Sie ihn mit 70% Ethanol reinigen. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Geräte vor dem Gebrauch und halten Sie die Geräte in Chlorhexidin, wenn sie während der Operation nicht verwendet werden. Decken Sie das Tier während der Operation mit einem OP-Tuch ab, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass alle Experimentatoren chirurgische Masken, sterile Handschuhe und Kittel tragen.
   Induzieren Sie die
   2. Anästhesie mit 1,5 - 2 % Isofluran bei einer Flussrate von 3 l/min und halten Sie sie während der gesamten Operation bei 1,5 - 2 % bei 2 l/min. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Pedalreflexes beim Einklemmen des Muskels zwischen den Zehen.
   3. Rasieren Sie einen 40 mm x 30 mm großen Bereich über dem Bauch von oberhalb der Leiste bis zum Brustbein.
   4. Rasieren Sie einen 30 mm x 20 mm großen Bereich über der Stirn, hinter den Augen und vor den Ohren.
   5. Desinfizieren Sie die beiden rasierten Stellen. Für den Stirnbereich dreimal mit 10 % Povidon-Jod desinfizieren (vermeiden Sie die Verwendung von Antiseptika auf Alkoholbasis für den Bereich in der Nähe des Auges, da dies dem von der Association of Surgical Technologists festgelegten Praxisstandard entspricht). Über dem Bauch mit 10 % Povidon-Jod und 70 % Ethanol desinfizieren.
   6. Tragen Sie 1 Tropfen Proxymetacain auf die Hornhaut auf, um eine zusätzliche topische Anästhesie
   zu erhalten.
   7. Tragen Sie 1 Tropfen Carboxymethylcellulose-Natrium auf die Hornhaut auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
2. Chirurgische Implantation
   1. Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen 10 mm großen Schnitt am Kopf entlang der vertikalen Mittellinie zwischen den Ohren.
   2. Machen Sie einen 5 mm großen Schnitt am Bauch durch die Hautschicht entlang der Mittellinie unterhalb des Brustbeins.
   3. Tunneln Sie eine Kanüle mit einem Durchmesser von 5 mm subkutan vom Bauchschnitt bis zum Kopfschnitt.
   4. Führen Sie die Elektrodendrähte (3 aktive und 3 inaktive) des Senders durch die Kanüle vom Bauch zum Kopf.
   5. Lassen Sie die Referenzelektrode mit dem Transmittersockel und decken Sie die Elektrodenspitze mit aseptischer Gaze ab.
   6. Decken Sie die Elektrodenspitzen (3 aktive und 3 inaktive) mit aseptischer Gaze ab.
   7. Befestigen Sie den Kopf der Ratte auf einer stereotaktischen Plattform.
   8. Verlängern Sie den Stirnschnitt mit einer chirurgischen Schere auf eine Länge von 30 mm.
   9. Legen Sie den Operationsbereich frei, indem Sie lose Haut mit 2 Nähten (3 - 0) bei ~ 3 und 9 Uhr zurückziehen.
   10. Kratzen Sie das Periost über dem Schädel mit sterilisierter Gaze ab, um Bregma-, Lambda- und Mittelliniennähte freizulegen.
   11. Bohren Sie zwei Löcher durch den Schädel an den aktiven (7 mm ventral zu bregma, 3 mm lateral zur Mittellinie) und inaktiven (5 mm rostral zu bregma an der Mittellinie) stereotaktischen Koordinaten.
   12. VEP aktive und inaktive Elektroden mit vormontierten Edelstahlschrauben (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm) mit einem kleinen Schraubendreher bis ~ 1 mm Tiefe am Schädel in die vorgefertigten Löcher befestigen. Dadurch wird die Schraube am Knochen verankert, ohne das darunter liegende kortikale Gewebe zu beschädigen.
   13. Um die ERG-Aktivelektroden zu implantieren, verwenden Sie eine 8 - 0 Naht, um das obere Augenlid vorübergehend zurückzuziehen.
   14. Führen Sie eine Kanüle von 16 bis 21 G subkutan von hinter dem Auge bis zum Fornix conjunctivalis superior ein.
   15. Entfernen Sie die Führungsnadel.
   16. Führen Sie die aktive Elektrode durch den verkürzten Kunststoffkatheter von der Stirn in Richtung Auge. Entfernen Sie dann den Kunststoffkatheter.
   17. Verwenden Sie eine provisorische Naht (8 - 0), die durch die Elektrodenschlaufe gefädelt wird, um ein Zurückziehen der Elektrode in den Tunnel zu verhindern.
   18. Machen Sie einen 0,5 mm großen Schnitt an der oberen Bindehaut bei 12 Uhr, 1 mm hinter dem Limbus. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um die darunter liegende Sklera freizulegen.
   19. Implantieren Sie eine 8 - 0 oder 9 - 0 Naht unmittelbar hinter dem Limbus bei halber Skleraldicke.
   20. Entfernen Sie die provisorische Naht von der aktiven ERG-Elektrode.
   21. Verankern Sie die aktive ERG-Elektrode an der Naht mit halber Skleradicke, indem Sie 3 aufeinanderfolgende Knoten binden und sicherstellen, dass sich die Elektrodenspitze in der Nähe des Limbus befindet.
   22. Den Bindehautlappen mit 1 bis 2 unterbrochenen Nähten (8 - 0 bis 9 - 0) verschließen. Stellen Sie sicher, dass die Bindehaut die ERG-Elektrode vollständig bedeckt, um den Komfort zu verbessern.
   23. Entfernen Sie die Naht zum Zurückziehen des Augenlids.
   24. Wiederholen Sie den Vorgang für das kontralaterale Auge.
   25. Tragen Sie Cyanacrylat-Gel auf den Schädel auf, um alle Edelstahlschrauben und Elektrodendrähte zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die aktiven ERG-Elektroden nicht zu fest gezogen werden, bevor Sie sie sichern, um Augenbewegungen zu ermöglichen.
   26. Verschließen Sie die Kopfwunde mit einer nicht resorbierbaren 3 - 0 Naht.
   27. Drehe das Nagetier, um den Bauchbereich freizulegen. Verlängern Sie den Bauchhautschnitt mit einer chirurgischen Schere auf 40 mm entlang der Linea alba.
   28. Machen Sie einen 35 mm großen Schnitt durch die innere Muskelwand, um die innere Bauchhöhle freizulegen.
   29. Mit zwei Nähten (3 - 0) wird der Senderkörper an der rechten Bauchinnenwand des Tieres befestigt. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Leber.
   30. Schlingen Sie die Masseelektrode und fixieren Sie sie in dieser Form mit einer Naht (3 - 0). Legen Sie es dann frei schwebend in die Bauchhöhle.
   31. Verschluss des Bauchfells mit einer durchgehenden Naht (3 - 0).
   32. Schließen Sie den Hautschnitt mit unterbrochenen Nähten (3 - 0).
3. Nachsorge
   1. Überwachen Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrecht zu erhalten. Halten Sie das Tier nach der Operation einzeln.
   2. Verabreichen Sie Carprofen subkutan zur Analgesie (5 mg/kg) einmal täglich für 4 Tage.
   3. Geben Sie 7 Tage nach der Operation prophylaktische orale Antibiotika (Enrofloxin, 5 mg/kg) in das Trinkwasser
   .
   4. Tragen Sie in den ersten 7 Tagen nach der Operation eine entzündungshemmende Salbe auf die Hautschnittstellen auf, um Reizungen zu reduzieren.

>3. Durchführung von ERG- und VEP-Aufzeichnungen an bewussten Ratten

1. Dunkle Anpassung des Tieres für 12 Stunden vor ERG- und VEP-Aufnahmen.
2. Führen Sie alle experimentellen Manipulationen unter schwacher roter Beleuchtung (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm) durch
3. Tragen Sie topische Anästhesietropfen (0,5 % Proxymetacain) und dilatierende (0,5 % Tropicamamid) Tropfen auf die Hornhaut auf.
4. Führen Sie den bewussten Nager in einen maßgeschneiderten, durchsichtigen Rückhaltebehälter.
   Anmerkung: Die Länge dieses Kunststoffrohrs kann an unterschiedlich große Ratten angepasst werden, wobei der Gesamtdurchmesser auf 60 mm festgelegt ist. Das vordere Ende des Geräts ist verjüngt, um Kopfbewegungen zu minimieren, und enthält Perforationen, um eine normale Atmung zu ermöglichen. Diese spitz zulaufende Front ermöglicht die Ausrichtung und Stabilisierung des Kopfes und der Augen der Ratte auf die Öffnung der Ganzfeldkugel. Beachten Sie, dass sich das Nagetier vor der Operation (3 bis 5 Mal) an das Zurückhaltemittel gewöhnt hat.
5. Setze den Nager vor die Ganzfeld-Schüssel, wobei die Augen auf der Öffnung der Schüssel ausgerichtet sind.
6. Schalten Sie den Verweilsender ein, indem Sie einen Magneten in einem Abstand von ~ 5 cm daran vorbeiführen. Überprüfen Sie dann, ob der Sender eingeschaltet ist, indem Sie die LED-Statusleuchte an der Empfängerbasis überprüfen.
7. Sammeln Sie Signale über einen Bereich von Lichtenergien (d. h. -5,6 bis 1,52 log cd.s.m²).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bioverstärker	ADInstruments	ML 135	Verstärkt ERG- und VEP-Signale
Carboxymethylcellulose Natrium 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Aufrechterhaltung der Hornhautfeuchtigkeit während der Operation
Carprofen 0,5%	Pfizer Animal Health Konzern	CAS 53716-49-7	Postoperative Analgesie, verabreicht mit injizierbarer Kochsalzlösung zur Flüssigkeitsauffüllung
Chlorhexadin 0,5%	Orion Laboratorien	27411, 80085	Desinfektion von chirurgischen Instrumenten
Cyanacrylat-Gel-Aktivator	RS-Komponenten	Nr. 473-439	Trocknet Cyanacrylat-Gel schnell
Cyanocrylat-Gel	RS-Komponenten	Nr. 473-423	Befestigen Sie rostfreie Schrauben am Schädel
Zahnfräser	Storz Instruments, Bausch und Lomb	Nr. E0824A	Miniatur-Bohrkopf mit ~0,7 mm Durchmesser zum Bohren eines kleinen Lochs in den Schädel über jeder Halbkugel zur Implantation von VEP-Schrauben
Bohrer	Bosch	Dremel 300 Serie	Automatischer Bohrer zum Trepanieren
Enrofloxin	Troy Laboratorien		Prophylaktisches Antibiotikum nach der Operation
Ganzfelder Ulbrichtsche Kugel	Photometric Solutions International		Speziell entwickelter Lichtstimulator: 36 mm Durchmesser, 13 cm Öffnungsgröße
Mulltupfer	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100 B.	Trocknet chirurgische Schnitte und freiliegende Schädeloberfläche während der Operation
Isofluran 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	Artikel-Nr.: 26675-46-7	Proprietärer Name: Isoflo(TM) Inhalationsanaästhetikum. Pharmazeutisches Inhalationsanästhetikum, gemischt mit Sauerstoffgas für die Chirurgie von VEP-Elektrodenimplantaten
Kenacomb Salbe	Aspen Pharma Pty Ltd		Zur Reduzierung von Hautreizungen und Juckreiz nach der Operation
Luxeon-LEDs	Phillips Lighting Co.		Für die Lichtstimulation zwanzig 5-Watt- und eine 1-Watt-LED, gesteuert von der Scope-Software
Nadel (Makrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	501959	zum Nähen von Bauch- und Kopfoperationen, verwendet mit 3-0 Naht, Augennadel, Schneide 5/16 Kreis Größe 1, 15mm
Nadelhalter (Makrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	500224	Zum Halten der Nadel bei Bauch- und Kopfoperationen
Nadelhalter (Mikrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	Artikel-Nr.: 555419NT	Um die Nadel während der Augenoperation zu halten
Optiva Katheter	Smiths Medical International GmbH	16 oder 21 G	Aktive Elektroden der Hornhaut vom Schädel zur Bindehaut führen
Povidon-Jod 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietärer Name: Betadine, Antiseptikum zur Vorbereitung der rasierten Haut auf die Operation 10%, 500 mL
Powerlab Datenerfassungssystem	ADInstruments	ML 785	Erfassen Sie das Signal vom Telemetriesender, gekoppelt mit dem Telemetriedatenkonverter
Proxymetacain 0,5%	Alcon Laboratorien	CAS-Nr. 5875-06-9	Topische okuläre Analgesie
Zurückhaltung	Cutom hergestellt		Die Vorderseite des Rückhaltesystems ist verjüngt, um die Kopfbewegung zu minimieren, die Länge kann an unterschiedliche Rattenlängen angepasst werden, der Gesamtdurchmesser beträgt 60 mm.
Scapel-Klinge	R.G. Medizinischer Bedarf	SNSM0206	Für chirurgische Inzisionen
Schere (Makrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	501225	zum Schneiden von Gewebe an den Bäuchen und der Stirn
Schere (Mikrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	501232	Zum Präparieren der Bindehaut für die Elektrodenbefestigung
Geltungsbereich Software	ADInstruments	Version 3.7.6	Löst gleichzeitig den Stimulus über das ADI Powerlab-System aus und sammelt Daten
Rasierapparat	Oster	Goldenes A5	Fell von Operationsbereichen rasieren
Rostfreie Streelschrauben	Mikro-Verbindungselemente	Nr. L001.003CS304	0,7 mm Wellendurchmesser, 3 mm Länge
Stereotaktischer Rahmen	David Kopf	Modell 900	Ein stereotaktisches Instrument für Kleintiere zur Lokalisierung der Implantationsmarkierungen auf dem Schädel
OP-Abdecktuch	Lebenswichtige medizinische Versorgung	GM29-612EE	Gewährleisten Sie eine sterile Umgebung während der Operation
Naht (Makrochirurgie)	Ninbo medizinische Nadeln	3:0	zum Nähen von Bauch- und Kopfoperationen, sterile Seide geflochten, 60cm
Nahtnadel (Mikrochirurgie)	Ninbo medizinische Nadeln	8-0 oder 9-0	für die Augenchirurgie inkl. Naht der Elektrode an die Sklera und Verschließen der Bindehautwunde, Nylonnaht, 3/8 Kreis 1×5, 30cm
Telemetrie-Datenkonverter	DataSciences International	Nr. R08	Ermöglicht die Schnittstelle des Telemetriesignals mit der Datenerfassungssoftware
Matrix für den Austausch von Telemetriedaten	DataSciences International		Sammelt Daten von Sendern, koppelt sie mit dem Empfänger
Empfänger von Telemetriedaten	DataSciences International	RPC-1	Empfängt Telemetriedaten vom Sender
Telemetrie-Sender	DataSciences International	F50-Elektro- und Elektronikgeräte	3-Kanal-Telemetrie-Sender
Tropicamid 0,5 %	Alcon Laboratorien		Iriserweiterung
Pinzette (Makrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	500092	Manipulieren Sie Gewebe bei Bauch- und Kopfoperationen
Pinzette (Mikrochirurgie)	Welt Präzisionsinstrumente	500342	Manipulieren Sie Gewebe während der Augenchirurgie