Elektroenzephalographische Aufzeichnung epileptischer Anfälle bei Epilepsie-induzierten Ratten

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Montage des Mikrodialyse-Sonden-Elektroden-Geräts

1. Verwenden Sie eine 3-Kanal zweifach gedrehte Elektrode (mit mindestens 20 mm Schnittlänge der Registrierungselektrode und einer 10 cm langen Erdungselektrode) und koppeln Sie diese an eine Führungskanüle, um das Gerät vorzubereiten. Beispiele für 3-Kanal-Elektroden und Führungskanülen für die Dialyse finden Sie in Abbildung 1A-1B.
2. Entfernen (Abbildung 1C) und führen Sie die Führungskanüle aus Metall vor der Verwendung einige Male in die Dummy-Kunststoffkanüle ein, um die Entnahme im Moment des Wechsels für die Mikrodialysesonde bei Tieren zu erleichtern.
3. Biegen Sie die verdrillten Drähte der Registrierungselektrode zweimal (Abbildung 1E-1F), um die Drähte mit der Dummy-Kanüle der Führung auszurichten, und schneiden Sie die Elektrodenspitze (Abbildung 1G) mit dem digitalen Messschieber so ab, dass sie 0,5 mm länger ist als die Spitze der Führungskanüle (Abbildung 1H).
4. Halten Sie den 1 mm langen Silikonring (Außendurchmesser [AD] 2 mm, Dicke 0,3 mm; Abbildung 1I) und führen Sie die Spitze der Führungskanüle und die Spitze der verdrillten Elektroden mit der Pinzette in den Silikonring ein (Abbildung 1J). Befestigen Sie es am Fuß des Führungskanülensockels mit Polymerkleber mit schneller Wirkung oder Harz (Abbildung 1K). Siehe das Beispiel der fertigen Geräte in Abbildung 1L und Abbildung 2A.
5. Sterilisieren Sie das Gerät 4 h lang unter keimtötendem ultraviolettem (UV) Licht. Drehen Sie das Gerät viermal um, so dass jede seiner Seiten 1 h lang dem Licht ausgesetzt ist>< Anmerkung: Viele selbstgebaute Elektroden und Mikrodialysesonden können auf ähnliche Weise zusammengebaut werden. Der Kopf des oben beschriebenen Implantats für Ratten hat folgende Abmessungen: 7 mm Breite x 5 mm Tiefe x 10 mm Länge von der Oberseite bis zur Sockelzehe; Die Implantatspitze ist ca. 11 mm lang, hat einen Durchmesser von 600 μm und das gesamte Gerät wiegt etwa 330-360 mg. Das Gerät kann zwei- oder dreimal wiederverwendet werden, wenn (i) während der Operation eine ausreichende Länge der Masseelektrode auf dem Schädel für die nächste Verwendung verbleibt und (ii) wenn das Tier getötet und das Gerät zusammen mit dem Zahnzement geborgen wird, es über Nacht in Aceton belassen wird, so dass der Zement mechanisch disaggregiert werden kann, und das Gerät wieder gewaschen und sterilisiert.

>2. Stereotaktische Chirurgie

1. Verwenden Sie für die Geräteimplantation ein stereotaktisches Gerät und einen Sondencliphalter (Abbildung 2B) gemäß den aktuellen Standards für aseptische und schmerzfreie Operationen.
   1. Betäuben Sie die adulten Sprague-Dawley-Ratten mit einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (43 mg/kg und 7 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]) und fixieren Sie es auf dem stereotaktischen Rahmen. Fügen Sie der anfänglichen Ketamin/Xylazin-Injektion eine Isofluran-Anästhesie (1,4% in Luft; 1,2 ml/min) hinzu, da dies ermöglicht, die Narkosetiefe rechtzeitig zu kontrollieren. Rasieren Sie das Fell auf dem Kopf des Tieres.
2. Tupfen Sie die Oberfläche der Kopfhaut mit einer Lösung auf Jodbasis und anschließend mit 70 % Ethanol ab, um sie für die aseptische Operation vorzubereiten.
   1. Die in der Reihenfolge (1,1 – 1,5) vorbereitete Führungskanüle und -elektrode wird mit folgenden Koordinaten in den rechten ventralen Hippocampus implantiert: Nasenbügel + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm zum Bregma. Befolgen Sie die Standardtechniken für stereotaktische Operationen.
   2. Achten Sie darauf, dass die Verankerungsschrauben nicht verdeckt werden. Wenn Sie es an der stereotaktischen Apparatur montieren, fassen Sie die Vorrichtung für den Führungskanülenkopf, da diese leicht auf den Sondenhalter ausgerichtet werden kann.
3. Verankern Sie das Gerät mit mindestens vier Edelstahlschrauben am Schädel und schrauben Sie diese in den Schädelknochen (1 Schraube in die linke und 1 Schraube in die rechte Stirnbeinplatte, 1 Schraube in die linke Scheitelplatte und 1 Schraube in die interparietalen Knochenplatten). Füge einen Tropfen Gewebekleber hinzu, um jede Schraube weiter am Schädelknochen zu befestigen.
   1. Bedecken Sie die Hälfte der Schraubengewinde mit Methacrylzement. Fördern Sie die Bindung des Zementes, indem Sie flache Rillen in den Knochen bohren, um die Haftung zu erhöhen.
4. Sobald die Spitze des Geräts im Hirngewebe positioniert ist, drehen Sie den Draht der Erdungselektrode um 3 Verankerungsschrauben. Decken Sie alle montierten Schrauben und das Gerät mit Zahnzement ab.
5. Überwachen Sie die Tiere während der Operation und danach etwa 1 Stunde lang, bis sie aufrecht stehen und sich im Käfig bewegen. Bewahren Sie sie auf einem Wärmekissen auf, um Unterkühlung zu vermeiden. Lassen Sie die Ratten sich mindestens 7 Tage nach der Implantation des Geräts erholen.
6. Überwachen Sie die Tiere mindestens einmal täglich für 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden. Geben Sie den Tieren 3 Tage lang die antibiotische Creme (Gentamycin 0,1%) in der Nähe der Einschnittstelle, um die Infektion zu verhindern, und ein Analgetikum (Tramadol 5 mg/kg, i.p.) zur Vorbeugung der postoperativen Schmerzen.

>3. Induktion der Temporallappenepilepsie durch Pilocarpin und Zuordnung von Tieren zu Versuchsgruppen

1. Nach einer Woche postoperativer Genesung werden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt: (i) Kontrolltiere, die das Vehikel erhalten, und (ii) epileptische Tiere, die Pilocarpin erhalten. Verwenden Sie eine proportional höhere Anzahl von Tieren für die epileptische Gruppe, da nicht alle Ratten, denen Pilocarpin verabreicht wird, die Krankheit entwickeln.
2. Injizieren Sie eine Dosis Methylscopolamin (1 mg/kg, subkutan [s.c.]) und 30 Minuten danach eine einmalige Injektion von Pilocarpin (350 mg/kg, i.p.), um den Status epilepticus (SE) zu induzieren. Injizieren Sie den Kontrollratten Methylscopolamin und das Vehikel (Kochsalzlösung). Verwenden Sie 1 ml-Spritze mit 25-G-Nadel für alle i.p. Verabreichungen.
   1. Überprüfen Sie visuell die Tiere, um Verhaltensanfälle zu bekommen (Vibrissa innerhalb von 5 Minuten bewegen, Kopf nicken, Klonen der Gliedmaßen) und innerhalb von 25 Minuten, um kontinuierlich den gesamten Körper zu klonen (SE).
3. Arrest der SE 2 Stunden nach dem Beginn, um eine Mortalität von etwa 25 % und eine mittlere Latenzzeit von etwa 10 Tagen durch Verabreichung von Diazepam (20 mg/kg, i.p.) zu erreichen. Beobachten und notieren Sie jedes Anfallsverhalten, das unmittelbar nach der Pilocarpin-Injektion beginnt und danach mindestens 6 Stunden lang anhält.
4. Geben Sie den Tieren Kochsalzlösung (1 ml, i.p.) mit 1 mL Spritze mit 25G Nadel und Saccharoselösung (1 mL, p.o.) mit 1 mL Spritze und flexibler Fütterung 17G Nadel für 2-3 Tage nach SE, um die Erholung des Körpergewichtsverlusts zu fördern.
   1. Die Tiere, die das Ausgangskörpergewicht nicht innerhalb der ersten Woche nach der Behandlung mit Pilocarpin SE erreichen, sind von der Studie auszuschließen (mit Ausnahme der akuten Gruppe, die 24 Stunden nach der SE getötet wurde und bei der eine Nachverfolgung des Körpergewichts nicht möglich ist).
5. Ordnen Sie Post-SE-Tiere nach dem Zufallsprinzip verschiedenen Versuchsgruppen zu (Abbildung 3): akute Phase (in der die Mikrodialyse 24 h nach SE stattfindet), Latenzzeit (7-9 Tage nach SE), erster spontaner Anfall (ca. 11 Tage nach SE) und chronische Periode (beginnt etwa 22-24 Tage nach SE, d.h. etwa 10 Tage nach dem ersten Anfall). Überwachen Sie die Tiere auf das Auftreten von spontanen Anfällen.
   Anmerkung: Verwenden Sie die folgenden Einschluss-/Ausschlusskriterien für weitere Experimente an epileptischen Ratten: Entwicklung eines konvulsiven SE innerhalb von 1 h nach Verabreichung von Pilocarpin; Gewichtszunahme in der ersten Woche nach SE und die korrekte Positionierung der Mikrodialysesonde und der Elektrode.

>4. Epileptische Verhaltensüberwachung und -analyse

1. Langzeitüberwachung des epileptischen Verhaltens
   1. Etwa 6 Stunden nach der Verabreichung von Pilocarpin (d.h. am Ende der direkten Beobachtung durch die Forscher) setzen Sie die Tiere in die sauberen Heimkäfige und starten Sie die 24-stündige Videoüberwachung.
   2. Setzen Sie die 24-Stunden-Videoüberwachung bis zum 5. Tag mit einem digitalen Videoüberwachungssystem fort.
   3. Ab Tag 5 verbinden Sie die Ratten in ihren rechteckigen Käfigen zu Hause mit dem angebundenen EEG-Aufzeichnungssystem und setzen die 24-Stunden-Videoüberwachung fort.
   4. Stellen Sie die Parameter an dem Verstärker ein, der außerhalb des Faradayschen Käfigs positioniert ist (stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf jedem Kanal entsprechend der Spezifität des EEG-Signals jedes einzelnen Tieres ein) und starten Sie die EEG-Erfassung, indem Sie das EEG-Signal beobachten, das von nicht angeschlossenen Kabeln erzeugt wird. Verwenden Sie eine Abtastrate von 200 Hz und einen Tiefpassfilter auf 0,5 Hz.
   5. Verbinden Sie das Tier mit Kabeln, die den Kopf eines Tieres zwischen zwei ausgestreckten Fingern einer Hand halten und schrauben Sie die Stecker mit der anderen freien Hand an den Elektrodensockel fest. Starten Sie die Akquise.
      Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass das Signal frei von Artefakten ist. Häufige Artefakte sind Stacheln, die den Maßstab weit überschreiten.
   6. Einen Tag vor dem Mikrodialyse-Experiment überführen Sie die Tiere in das angebundene EEG-System, das mit Plexiglaszylindern für die Mikrodialyse ausgestattet ist. Trennen Sie die Tiere vom EEG-Anbindesystem im Heimkäfig, indem Sie die Stecker von der Elektrode verschrauben, ohne das Tier zurückzuhalten. Setze das Tier in die hohen Plexiglaszylinder.

Abbildung 1. Schritt-für-Schritt-Vorbereitung des zu implantierenden Geräts. (A) 3-Kanal-Elektrode mit 10 cm langer Erdungselektrode in der Schutzhülle auf der linken Seite und Führungskanüle für die Mikrodialyse auf der rechten Seite, die für den Zusammenbau des Gerätes benötigt wird. (B). Die blanke Elektrode und die Führungskanüle im Detail. Der erste Schritt besteht darin, die Metallführungskanüle einige Male aus und in ihren Kunststoffschnuller zu entfernen (C) und einzuführen (D), um ihre Freigabe nach der Implantation in den Kopf des Tieres zu erleichtern. Der zweite Schritt besteht darin, die verdrillte Registrierungselektrode zweimal zu biegen, um sie auf die Dialyseführungskanüle (E, F) auszurichten. (G) Die Elektrodenspitze sollte so geschnitten werden, dass sie 0,5 mm länger ist als die Spitze der Metallführungskanüle. (H) Überprüfen Sie die Präzision des Schnitts mit dem digitalen Messschieber. Anschließend sollte ein ca. 1 mm langer Silikonring verwendet werden, um die Ausrichtung der Elektrode an der Führung des Kanülenfußes (I) zu fixieren. (J) Das Foto, das zeigt, wie die Elektrode klingelt und der Kanülenschaft geführt wird. Der letzte Schritt besteht darin, einen Tropfen Harz oder Kleber auf den Sockel der Führungskanüle zu geben und den Silikonring daran zu befestigen (K). (L) Zusammengebautes Gerät, bereit zur Sterilisation.

Abbildung 2. Fotos von verschiedenen Arten von Geräten für die Mikrodialyse-EEG bei Ratten, die verwendet wurden (A) und das Foto des Sondencliphalters (B), der zur Implantation dieser Geräte verwendet wurde. (A) Die Führungskanüle (grün) wird in der Regel 24 h vor dem Versuch durch eine Mikrodialysekanüle ersetzt. Der elektrische Anschluss des Geräts (der erste von links wurde für die in diesem Manuskript beschriebenen Aufnahmen verwendet) ermöglicht den Anschluss von Drähten, die elektrische Signale an den Verstärker und die Datenerfassungsausrüstung leiten. Das Gerät wird chirurgisch am Schädel von anästhesierten Ratten befestigt und Aufzeichnungen können später gemacht werden, ohne Schmerzen oder Unbehagen bei frei verhaltenden Ratten zu verursachen.

Abbildung 3. Experimentelle Gestaltung. In der Woche vor der Induktion des Status epilepticus (SE) wird den Ratten das Gerät implantiert. SE wird durch Pilocarpin induziert und die Tiere (wenn sie nicht dialysiert und 24 h nach SE getötet werden; die Ratten aus der Akutgruppe) werden 5 Tage lang videoüberwacht (blaue Linie) und dann per Video-EEG überwacht, um die Häufigkeit und Dauer der Anfälle in ihren häuslichen Käfigen zu beurteilen (grüne Linie). Für das Mikrodialyse-Experiment werden die epileptischen und die jeweiligen nicht-epileptischen Kontrollratten 24 h vor der Mikrodialysesitzung in eine andere EEG-Anlage überführt, die mit Zylinderkäfigen ausgestattet ist und weiterhin per Video-EEG überwacht wird (hellgrüne Linie). Die vertikalen roten Linien stellen die Dialysesitzungen zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung epileptischer Erkrankungen dar. Die horizontalen roten Linien stellen die verschiedenen Gruppen von epileptischen Tieren (und entsprechenden nicht-epileptischen Tieren) dar, wobei der Pfeil den letzten Tag der Mikrodialyse und den Todestag des Tieres anzeigt.