Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Aufzeichnung synaptischer Reaktionen in einer Submersionsschichtkammer
HINWEIS: Siehe Materialtabelle.
- Die aCSF-Lösung in einem Wasserbad auf ca. 28-30 °C vorwärmen (dies verhindert die Blasenbildung in der Aufnahmekammer).
- Starten Sie das Recyclingsystem (4-5 mL/min) und aktivieren Sie die Inline-Heizung, um das System für mindestens 1 h auszugleichen.
- Tränken Sie ein kleines Stück Linsenreinigungspapier und ein Nylonnetz, das auf einem U-förmigen Platindraht befestigt ist, einige Minuten lang in der Tauchscheibenkammer (Abbildung 1).
- Entfernen Sie den U-förmigen Platindraht.
- Schalten Sie das Recycling aus und legen Sie eine Scheibe auf das Linsenreinigungspapier.
- Platzieren Sie sofort das Scheibenhaltenetz auf der Scheibe, schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Scheibe 30 Minuten lang äquilibrieren, ohne das Objektiv in das aCSF zu tauchen.
- Füllen Sie die Borosilikat-Mikropipette (d.h. die Aufzeichnungselektrode) mit aCSF (Spitzenwiderstand: 1-2 MΩ, gefüllt zu 1/3 mit aCSF) und montieren Sie sie in den Pipettenhalter.
- Platzieren Sie die geprüfte epoxidisolierte Wolfram-Stimulationselektrode in der Halterung des Manipulators und die Referenzdrähte in der Scheibenkammer.
- Fügen Sie der Kammer eine zweite Referenzelektrode hinzu und schließen Sie sie an die Referenzbuchse des Kopftisches der Aufnahmeelektrode an (Abbildung 1A).
- Klicken Sie in der Verstärkersteuerungssoftware auf das Feld "Zero Clamp Mode" und doppelklicken Sie auf das Feld "Output Gain List". Wählen Sie eine Verstärkung von "100", doppelklicken Sie auf das Listenfeld "Hochpassfilter (Bessel)", wählen Sie "0,1 Hz" und doppelklicken Sie auf das Listenfeld "Tiefpassfilter (AC)", um "3 kHz" auszuwählen.
- Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf "Erfassen | Offenes Protokoll." Wählen Sie ein Protokoll, dessen Einstellungen episodische Stimulationen und die Digitalisierung verstärkter Potentiale bei 10-20 kHz für 50-100 ms ermöglichen und das 10 ms nach dem Start einer episodischen Aufzeichnung automatisch einen Stimulus-Isolator auslöst.
- Platzieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden z.B. in einer Linie und parallel zum Stratum pyramidale (Abbildung 1B und Abbildung 2).
- Klicken Sie auf "Erwerben | Edit Protocol" und wählen Sie die Registerkarte "Trigger" (im Popup-Fenster). Klicken Sie auf das Feld "Triggerquelle" und wählen Sie "Leertaste" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen", um die Erfassung zu starten, und beachten Sie das Popup-Fenster mit einer Auslöseschaltfläche.
- Klicken Sie in der Stimulus-Isolator-Software auf das Feld "Spannungssteuerung" und geben Sie "0" ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Download". Klicken Sie auf das Fenster "Aufnahmesoftware" und drücken Sie die Leertaste. Wiederholen Sie diesen Zyklus, indem Sie nacheinander Werte von 1 bis 8 eingeben, z. B. in 1-mV-Schritten in das Feld "Spannungsregelung".
- Korrelieren Sie die Stimulationsstärke mit den fEPSP-Steigungswerten und bestimmen Sie die Stimulationsstärke, die erforderlich ist, um 40% des fEPSP-Steigungsmaximums zu erreichen. Klicken Sie auf das "Spannungsregelfeld" und geben Sie den ermittelten Wert ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Download".
Anmerkung: Ein Stimulus-Isolator wird verwendet, um kurze Spannungs- oder Stromimpulse an das Hirngewebe anzulegen. Die biphasischen Pulse können 100 μs pro Phase haben.
- Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf die Stopp-Schaltfläche und dann auf das Menü "Erwerben". Klicken Sie auf "Protokoll bearbeiten" und wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte "Trigger". Klicken Sie auf das Feld für die Triggerquelle und wählen Sie den "internen Timer" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche, mit der z.B. alle 30 s die automatische Aufzeichnung von Feldpotentialen gestartet wird. Klicken Sie nach 30-60 Minuten auf die Schaltfläche "Stopp".
- Klicken Sie auf das Menü "Erwerben", klicken Sie auf "Protokoll öffnen", wählen Sie das gewünschte Induktionsprotokoll der synaptischen Plastizität aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnahme", um die hochfrequente Stimulation und Aufnahme automatisch zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp".
Anmerkung: Im Falle von Studien, die sich auf synaptische Plastizität beziehen, wenden Sie eines der Standard-Induktionsparadigmen für Langzeitpotenzierung oder Langzeitdepression nach längerer Baseline-Aufzeichnung an. Repräsentative Beispiele für die resultierende Modulation der synaptischen Übertragung sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt.
- Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf "Erfassen | Open Protocol" und wählen Sie das gleiche Protokoll wie in Schritt 4.12. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" und dann auf "Aufnahme". Lassen Sie die Feldpotentialaufzeichnungen z.B. automatisch für 2-4 Stunden laufen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", um die Aufnahme zu beenden.
- Bei pharmazeutischen Studien ist die Verbindung direkt auf das aCSF-Reservoir aufzutragen, wenn eine dauerhafte Verabreichung der Verbindung gewünscht ist (Abbildung 3).
