Methodenartikel

Aufzeichnung exzitatorischer postsynaptischer Potentiale im neuronalen Feld in akuten Hippocampus-Schnitten

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Weng, W., et al. Aufzeichnung der synaptischen Plastizität in akuten Hippocampus-Schnitten, die in einem kleinvolumigen Recycling-, Perfusions- und Tauchkammersystem gehalten werden. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einrichten eines Gehirnschnitts in einer Tauchkammer, um synaptische Aktivität aufzuzeichnen. Der Prozess umfasst die Befestigung der Scheibe auf Linsenpapier, die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Flusses von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF), um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu gewährleisten, und die genaue Positionierung der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden relativ zu einer bestimmten Gehirnregion. Dieser Aufbau ermöglicht eine präzise Überwachung der synaptischen Aktivität zu Studienbeginn und der Auswirkungen der elektrischen Stimulation.

Protokoll

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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Aufzeichnung synaptischer Reaktionen in einer Submersionsschichtkammer

HINWEIS: Siehe Materialtabelle.

  1. Die aCSF-Lösung in einem Wasserbad auf ca. 28-30 °C vorwärmen (dies verhindert die Blasenbildung in der Aufnahmekammer).
  2. Starten Sie das Recyclingsystem (4-5 mL/min) und aktivieren Sie die Inline-Heizung, um das System für mindestens 1 h auszugleichen.
  3. Tränken Sie ein kleines Stück Linsenreinigungspapier und ein Nylonnetz, das auf einem U-förmigen Platindraht befestigt ist, einige Minuten lang in der Tauchscheibenkammer (Abbildung 1).
  4. Entfernen Sie den U-förmigen Platindraht.
  5. Schalten Sie das Recycling aus und legen Sie eine Scheibe auf das Linsenreinigungspapier.
  6. Platzieren Sie sofort das Scheibenhaltenetz auf der Scheibe, schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Scheibe 30 Minuten lang äquilibrieren, ohne das Objektiv in das aCSF zu tauchen.
  7. Füllen Sie die Borosilikat-Mikropipette (d.h. die Aufzeichnungselektrode) mit aCSF (Spitzenwiderstand: 1-2 MΩ, gefüllt zu 1/3 mit aCSF) und montieren Sie sie in den Pipettenhalter.
  8. Platzieren Sie die geprüfte epoxidisolierte Wolfram-Stimulationselektrode in der Halterung des Manipulators und die Referenzdrähte in der Scheibenkammer.
  9. Fügen Sie der Kammer eine zweite Referenzelektrode hinzu und schließen Sie sie an die Referenzbuchse des Kopftisches der Aufnahmeelektrode an (Abbildung 1A).
  10. Klicken Sie in der Verstärkersteuerungssoftware auf das Feld "Zero Clamp Mode" und doppelklicken Sie auf das Feld "Output Gain List". Wählen Sie eine Verstärkung von "100", doppelklicken Sie auf das Listenfeld "Hochpassfilter (Bessel)", wählen Sie "0,1 Hz" und doppelklicken Sie auf das Listenfeld "Tiefpassfilter (AC)", um "3 kHz" auszuwählen.
  11. Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf "Erfassen | Offenes Protokoll." Wählen Sie ein Protokoll, dessen Einstellungen episodische Stimulationen und die Digitalisierung verstärkter Potentiale bei 10-20 kHz für 50-100 ms ermöglichen und das 10 ms nach dem Start einer episodischen Aufzeichnung automatisch einen Stimulus-Isolator auslöst.
  12. Platzieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden z.B. in einer Linie und parallel zum Stratum pyramidale (Abbildung 1B und Abbildung 2).
  13. Klicken Sie auf "Erwerben | Edit Protocol" und wählen Sie die Registerkarte "Trigger" (im Popup-Fenster). Klicken Sie auf das Feld "Triggerquelle" und wählen Sie "Leertaste" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen", um die Erfassung zu starten, und beachten Sie das Popup-Fenster mit einer Auslöseschaltfläche.
  14. Klicken Sie in der Stimulus-Isolator-Software auf das Feld "Spannungssteuerung" und geben Sie "0" ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Download". Klicken Sie auf das Fenster "Aufnahmesoftware" und drücken Sie die Leertaste. Wiederholen Sie diesen Zyklus, indem Sie nacheinander Werte von 1 bis 8 eingeben, z. B. in 1-mV-Schritten in das Feld "Spannungsregelung".
  15. Korrelieren Sie die Stimulationsstärke mit den fEPSP-Steigungswerten und bestimmen Sie die Stimulationsstärke, die erforderlich ist, um 40% des fEPSP-Steigungsmaximums zu erreichen. Klicken Sie auf das "Spannungsregelfeld" und geben Sie den ermittelten Wert ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Download".
    Anmerkung: Ein Stimulus-Isolator wird verwendet, um kurze Spannungs- oder Stromimpulse an das Hirngewebe anzulegen. Die biphasischen Pulse können 100 μs pro Phase haben.
  16. Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf die Stopp-Schaltfläche und dann auf das Menü "Erwerben". Klicken Sie auf "Protokoll bearbeiten" und wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte "Trigger". Klicken Sie auf das Feld für die Triggerquelle und wählen Sie den "internen Timer" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche, mit der z.B. alle 30 s die automatische Aufzeichnung von Feldpotentialen gestartet wird. Klicken Sie nach 30-60 Minuten auf die Schaltfläche "Stopp".
  17. Klicken Sie auf das Menü "Erwerben", klicken Sie auf "Protokoll öffnen", wählen Sie das gewünschte Induktionsprotokoll der synaptischen Plastizität aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnahme", um die hochfrequente Stimulation und Aufnahme automatisch zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp".
    Anmerkung: Im Falle von Studien, die sich auf synaptische Plastizität beziehen, wenden Sie eines der Standard-Induktionsparadigmen für Langzeitpotenzierung oder Langzeitdepression nach längerer Baseline-Aufzeichnung an. Repräsentative Beispiele für die resultierende Modulation der synaptischen Übertragung sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt.
  18. Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf "Erfassen | Open Protocol" und wählen Sie das gleiche Protokoll wie in Schritt 4.12. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" und dann auf "Aufnahme". Lassen Sie die Feldpotentialaufzeichnungen z.B. automatisch für 2-4 Stunden laufen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", um die Aufnahme zu beenden.
  19. Bei pharmazeutischen Studien ist die Verbindung direkt auf das aCSF-Reservoir aufzutragen, wenn eine dauerhafte Verabreichung der Verbindung gewünscht ist (Abbildung 3).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Komponenten der Ausström-Aufkohlung für Versuche in einer Tauchschichtkammer. (A) Darstellung der Tauchscheibenkammer. Dargestellt ist der U-förmige Platindraht mit Nylonfasern, der eine Hippocampusscheibe hält. Die Silberdrähte wurden um eine kleine Kanüle gewickelt, wodurch eine Spule entstand, um die Fläche des Silberdrahtendes zu vergrößern. Der Stimulationsrefere...

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Elektrophysiologische Geräte und Materialien
Vertikaler PipettenabzieherNarishige, JapanPC-10
Tisch zur SchwingungsisolierungMeirits, JapanADZ-A0806
Untergetauchte AufnahmekammerWarner InstrumentsRC-26GLP
Thermostatisches WasserbadZhongcheng Yiqi, ChinaHH-1
4-Achsen-MikromanipulatorSutter, Vereinigte Staaten von AmerikaMP-285, MP-225
Platin-DrahtWelt PräzisionsinstrumentePTP406
VerstärkerMolecular Devices, USAMulticlamp 700B
DatenerfassungssystemMolecular Devices, USADigidata 1440A
Analyse-SoftwareMolecular Devices, USAClampex 10.2
FluoreszenzmikroskopNikon, JapanFN1
LED-LichtquelleLumen Dynamics Group, KanadaX-cite 120LED
MikropipettenHarvard-ApparaturGC150TFExtrazelluäre Aufnahme
Mikropipetten aus BorosilikatglasSutter, Vereinigte Staaten von AmerikaBF150-86Patch-Klemme
Wolfram-ElektrodeA-M Systems, USAArtikel-Nr.: 575500
Peristaltische PumpeLonger, ChinaBT00-300T
Schläuche für die SchlauchpumpeISMATEC, Wertheim, DeutschlandNr. SC03091x Zulauf, ID: 1.02mm
Schläuche für die SchlauchpumpeISMATEC, Wertheim, DeutschlandNr. SC03192x Rohre für Abfluss, ID: 2.79 mm
CCD-KameraPCO, Deutschlandpco.edge sCMOS
Reinigungspapier für BrillengläserKodak
50 ml konisches ZentrifugenröhrchenThermowissenschaftlich339652
VorkammerWarner InstrumentsBSC-PC
Inline-HeizungWarner InstrumentsSF-28
TemperaturreglerWarner InstrumentsTC-324B
Erforderliche Reagenzien
NaClSinopharm Chemisches Reagenz,
China		10019318
KclSinopharm Chemisches Reagenz,
China		10016318
KH2PO4Sinopharm Chemisches Reagenz,
China		10017618
MgCl2,6H 2OSinopharm Chemisches Reagenz,
China		10012818
CaCl2Sinopharm Chemisches Reagenz,
China		10005861
NaHCO3Sinopharm Chemisches Reagenz,
China		10018960
TraubenzuckerSinopharm Chemisches Reagenz,
China		10010518
NaH2PO4Sinopharm Chemisches Reagenz,
China		20040718
HEPES Sigma Nr. H3375
Natriumpyruvat Sigma Nr. A4043
MgSO4Sinopharm Chemisches Reagenz,
China		20025118
NaOHSinopharm Chemisches Reagenz,
China		10019718

Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Hippocampal SliceField EPSPSubmersion ChamberArtificial Cerebrospinal FluidStimulation ElectrodeRecording ElectrodeElectrophysiology RecordingSynaptic TransmissionNeuronal ExcitabilityBrain Slice Preparation

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