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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Aufbau und Vorbereitung
- Lösungen
- Bereiten Sie künstliche Stammlösungen für die Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) nach den folgenden Rezepten vor. Andere Rezepte mit Konzentrationsvariationen sind in der Literatur verfügbar. Lagern Sie Stammlösungen bis zu einem Monat bei 4 °C.
- Salzlösung: 75,39 g NaCl (129 mM endgültig), 2,5 g KCl (3,35 mM endgültig), 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM endgültig), 2,33 g MgCl2 (1,15 mM endgültig), 1,85 g CaCl2 (1,26 mM) zugeben. In 800 ml destilliertem Wasser auflösen und auf 1 l mit destilliertem Wasser auffüllen.
- Bikarbonatlösung: 17,65 g NaHCO3 (21 mM endgültig) zugeben. In 900 ml destilliertem Wasser auflösen und auf 1 l mit destilliertem Wasser auffüllen. Schwankungen der Bicarbonatkonzentration führen zu Schwankungen des pH-Werts.
- Glukoselösung: 54,06 g Glukose (30 mM endgültig) zugeben. In 400 ml destilliertem Wasser auflösen und auf 500 ml mit destilliertem Wasser auffüllen.
- Bereiten Sie aCSF vor, indem Sie 100 ml Salzlösung, 100 ml Bicarbonatlösung und 50 ml Glukoselösung in 1 l destilliertem Wasser verdünnen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Glaselektrode vor, indem Sie ein Glasrohr erwärmen und dehnen, bis es bricht. Schleifen Sie die Spitze vor Gebrauch ab. Die Elektrode kann viele Male wiederverwendet werden, solange sie sauber bleibt.
- Experimenteller Aufbau
Anmerkung: Die Details zur Einrichtung sind in Abbildung 1 dargestellt.
- Schalten Sie den Verstärker, den gleitenden Mittelwert, das Datenerfassungssystem, den Temperaturregler und die Pumpe ein. Überprüfen Sie die Signalverstärkung (Verstärkung = 10.000), die Filterung (niedrige Schwelle, 10 Hz; obere Schwelle, 5 kHz) und die Abtastrate der Analog-Digital-Wandlung des Rohsignals (2,5 kHz).
- Füllen Sie eine Flasche mit Liquor und blasen Sie sie mit Carbogen (95% O2, 5% CO2). Induzieren Sie einen blasenförmigen und erwärmten aCSF-Fluss in der Aufnahmekammer (Volumen 5 ml) bei 4 ml/min. Halten Sie die Temperatur in der Aufnahmekammer bei 26 (± 1) °C. Unter diesen Standardbedingungen sollte der pH-Wert 7,4 betragen.
- Bewahren Sie 50 ml aCSF bei Raumtemperatur (RT) und karbogenblasiertes aCSF in einer 50 ml Spritze in der Nähe der Präparierkammer auf.
- Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Aufnahmesoftware.
>2. Sezieren
- Wiegen und bestimmen Sie das Geschlecht des Tieres visuell (Männchen haben einen längeren anogenitalen Abstand, während Weibchen einen kurzen anogenitalen Abstand haben; männliche Genitalien sind oft dunkel, während weibliche Genitalien rosa sind).
- Betäuben Sie die neugeborenen Nagetiere mit einer der folgenden Optionen: Kryoanästhesie (das Tier 4 – 5 Minuten lang vollständig in Eis tauchen), Injektion (Equitensin in 4 ml/kg) oder Inhalation von flüchtigen Anästhetika (Isofluran oder Äther). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesieebene durch das Fehlen eines Pfotenrückzugsreflexes.
- Legen Sie das Tier mit dem Bauchgesicht nach unten auf die Bank. Schneiden Sie den rostralen Teil des Kopfes mit einem Skalpell auf Höhe des Bregmas (sichtbar durch die Haut und den Schädel) koronal ab. Führen Sie diesen Schritt unmittelbar nach der Betäubung des Tieres durch.
- Schneiden Sie den Körper mit einem Skalpell koronal unter den vorderen Gliedern ab.
- Entfernen Sie Haut, Muskeln, Fettgewebe und Eingeweide mit chirurgischen und dünnen Scheren und Zangen. Da die Knochen in diesem Alter weich sind, sollten Sie darauf achten, das Nervensystem nicht zu schädigen. Führen Sie diesen Schritt auf der Bank aus.
- Legen Sie das Präparat in die Präparierkammer. Verwenden Sie das in der Spritze aufbewahrte aCSF, um das Präparat mit Sauerstoff zu versorgen. Verwenden Sie von diesem Punkt bis zum Ende der Aufnahme ein Mikroskop.
- Schneiden Sie auf der dorsalen Seite des Präparats den Schädel und die Wirbel vom rostralen bis zum kaudalen Teil entlang der mittleren Achse mit einer chirurgischen und dünnen Schere und Zange ab. Öffnen Sie den aufgeschnittenen Schädel und die Wirbel, um das Nervengewebe freizulegen. Verwenden Sie das in der Spritze aufbewahrte aCSF, um das Präparat mit Sauerstoff zu versorgen.
- Entfernen Sie mit der Zange die Arachnoidalmembran, ein dünnes Gewebe, das die Oberfläche des Nervengewebes bedeckt. Halten Sie die Pia mater und die Blutgefäße gegen das Nervengewebe zurück. Verwenden Sie das in der Spritze aufbewahrte aCSF, um das Präparat mit Sauerstoff zu versorgen.
- Legen Sie das Präparat mit der dorsalen Vorderseite nach unten und bringen Sie den Hirnstamm und das Rückenmark vorsichtig nach unten, indem Sie die Nerven und das Bindegewebe mit der Schere durchtrennen, während Sie das Präparat an Ort und Stelle halten. Auch ein dorsaler Zugang ist möglich. Bewahren Sie die Wurzeln und Nerven so lange wie möglich auf. Entfernen Sie die Knochen, um den Hirnstamm und das Rückenmark zu isolieren. Verwenden Sie das in der Spritze aufbewahrte aCSF, um das Präparat mit Sauerstoff zu versorgen.
- Entfernen Sie das Kleinhirn und die verbleibenden rostralen Strukturen, indem Sie sie mit dem Skalpell durchtrennen. Verwenden Sie das in der Nadel gespeicherte aCSF, um das Präparat mit Sauerstoff zu versorgen.
- Gegebenenfalls je nach Versuchsaufbau die Pons mit dem Skalpell durch einen Koronalschnitt anterior der Arteria cerebellaris inferior entfernen. Beachten Sie, dass das Aufbewahren des ganzen Pons den Rhythmus bei Ratten verlangsamt und bei Mäusen vollständig hemmt. Präparate, die nur den kaudalen Teil des Pons umfassen, zeigen eine respiratorische Aktivität mit einer stabilen Frequenz an der C4-Wurzel.
>3. Aufnahme
- Legen Sie das Präparat mit der Bauchlage nach oben in die Aufnahmekammer. Fixieren Sie das Präparat mit Stecknadeln im untersten Teil des Rückenmarks und im rostralsten Teil des Hirnstamms.
- Mit einer Spritze, die über die Nadel mit der Elektrode verbunden ist, durch Herausziehen des Spritzenkolbens eine Vertiefung in der Elektrode (Durchmesser der Glasspitze: 150 - 225 μm) herbeiführen, um die Elektrode teilweise mit aCSF zu füllen.
- Platzieren Sie die Elektrode mit einem Mikromanipulator vorsichtig in der Nähe einer der vierten ventralen Wurzeln. Auch andere ventrale Wurzeln können eine respiratorische Aktivität aufweisen (z.B. Hirnnerv XII, C1 ventrale Wurzel).
- Induzieren Sie über die Spritze eine Vertiefung im Elektrodentank, indem Sie den Kolben herausziehen, um das Nervenwurzelchen sanft abzusaugen. Bewegen Sie dann vorsichtig die Elektrode, um sie gegen das Rückenmark zu legen.
Anmerkung: Im Idealfall entspricht die Größe des Rootlets der Größe der Elektrodenöffnung und schafft so eine Abdichtung zwischen dem Innen- und Außenfach der Elektrode. Da für solche Aufnahmen üblicherweise Differenzverstärker verwendet werden, verringert jede Öffnung zwischen dem Inneren der Elektrode und der Aufnahmekammer die Qualität des Signals und erschwert die Beseitigung von Hintergrundgeräuschen.
- Starten Sie die Aufnahme.
- Der Rhythmus, den das Präparat unter normoxischen Bedingungen (d. h. aLiquor mit Karbogen blasiert: 95 % O2 und 5 % CO2) erzeugt, ist mindestens 20 Minuten lang zu protokollieren, um die Ausgangsparameter des Präparats zu bestimmen.
- Schalten Sie die Perfusion für 15 Minuten von karbogenblasiertem aCSF auf Stimulus-aCSF um (d.h. blasiert mit 95% N2 und 5% CO2 für den Hypoxie-Stimulus). Ändern Sie die Expositionsdauer je nach experimentellem Protokoll. Die Expositionsdauer ist auf dem Aufzeichnungs- und Tierdatenblatt zu vermerken. Verwenden Sie nach Möglichkeit Edelstahlrohre zwischen der aCSF-Flasche und der Kammer, um eine Gasdiffusion nach außen zu vermeiden.
- Schalten Sie die Perfusion für mindestens 15 Minuten auf Standard-karbogenblasen-aLiquf zurück, um eine Erholungsaufnahme zu machen. Halten Sie dies auf dem Aufzeichnungs- und Tierdatenblatt fest.
- Beenden Sie die Aufnahme.
