Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Chirurgische Vorbereitung
- Reinigen und bereiten Sie den Transmitter vor, um eine sichere und sterile Operation zu gewährleisten. Nehmen Sie den Transmitter aus der antistatischen Verpackung und sprühen Sie ihn entweder auf 70 % Ethanol oder weichen Sie ihn ein. Spülen Sie den Transmitter mit steriler Kochsalzlösung aus und legen Sie ihn zwischen sterile Watteschwämme, die in steriler Kochsalzlösung getränkt sind, oder halten Sie ihn in steriler Kochsalzlösung untergetaucht.
- Sammeln und sterilisieren Sie die für die Operation erforderlichen Werkzeuge, Dampfautoklaven zur Sterilisation. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Liste der chirurgischen Instrumente.
>2. Chirurgische Implantation
- Betäuben Sie die Tiere und halten Sie die Anästhesie gemäß dem von der IACUC zugelassenen Protokoll aufrecht. Zu Beginn und während der Operation ist der Zehenkneifreflex alle 15 Minuten zu kontrollieren. Das Fehlen eines Ansprechens deutet auf ein ausreichendes Maß an Anästhesie hin.
- Bei Welpen ist eine Anästhesie mit Isofluran (4%) und O2 (100%) anzuwenden. Für Erwachsene verwenden Sie Ketamin (100 mg/kg) mit Xylazin (10 mg/kg).
- Fixieren Sie die Position im stereotaktischen Rahmen. Platzieren Sie die Ohrstöpsel in den Gehörgang. Ziehen Sie die Ohrstangen nicht zu fest an, da der Schädel bei jungen Rattenwelpen sehr weich ist. Sichern Sie den Anästhesie-Nasenkonus.
- Halten Sie das Tier während der Operation warm, indem Sie es auf das auf 37 °C eingestellte Heizkissen legen. Tragen Sie bei erwachsenen Tieren eine Gleitsalbe auf die Augen des Tieres auf.
- Sterilisieren Sie die Inzisionsstelle und halten Sie das Operationsfeld steril.
- Tupfen Sie die Kopfhaut abwechselnd mit 70% Ethanol und Betadin ab. Beginnen Sie in der Mitte der Kopfhaut und machen Sie immer breitere konzentrische Kreise.
- Decken Sie das Tier mit einem Tuch ab und führen Sie die Operation über dem drapierten Tier durch. Pflegen Sie das sterile Operationsfeld, indem Sie die chirurgische Einrichtung mit sterilen Abdecktüchern auskleiden und die Ausrüstung mit 70% Ethanol besprühen.
- Tragen Sie sterile OP-Handschuhe und einen Kittel (oder wie von der Institution vorgeschrieben). Um ein steriles Feld zu erhalten, verwenden Sie einen chirurgischen Assistenten.
- Machen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut des Tieres etwas hinter den Augen entlang der Mittellinie, ca. 2 cm. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Skalpell einführen, da der Schädel bei jungen Rattenbabys noch sehr weich ist. Machen Sie einen einzigen Schnitt, damit der Schnitt weniger blutet und schneller heilt.
- Lege den Schädel frei. Bereiten Sie einen sauberen und trockenen Bereich vor, um die Verbindung zwischen dem Sender und den Knochen des Schädels zu maximieren. Verwenden Sie Aneurysma-Clips, um die Kopfhaut zu greifen.
- Ziehe die Kopfhaut an vier Ecken vorsichtig von der Mittellinie weg. Achten Sie auf anatomische Orientierungspunkte wie Bregma und Lambda im Schädel. Denken Sie daran, dass Schädelknochen bei Tieren in diesem Alter nicht verschmolzen sind. Verwenden Sie den Paxinos-Atlas der stereotaktischen Koordinaten, um die richtige Position für das Bohrloch zu finden.
- Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug mit einem Fräser. Erstellen Sie zwei Fräslöcher an den gewünschten Aufnahmepositionen, wobei die Löcher einen Durchmesser von mehr als 300 μm haben. Platzieren Sie das Bohrloch für die Referenzelektrode über dem Kleinhirn hinter dem Lambda des Schädels.
- Stellen Sie sicher, dass die Drähte am Messumformer mit den Bohrlöchern ausgerichtet sind. Wenn die Elektrodendrähte nicht ausgerichtet sind, ist es wahrscheinlich, dass die Elektroden durch Klebstoff verunreinigt werden, was zu einem schlechten Signal führt. Um die Drähte auszurichten, überprüfen Sie den Sitz des Senders und biegen Sie die Elektroden vorsichtig so, dass sie über den vorgesehenen Stellen für Bohrlöcher ausgerichtet sind.
- Trimmen Sie die Elektrodenleitungen. Schneiden Sie die Elektroden mit einer chirurgischen Schere auf die gewünschte Länge ab. Die Elektrodentiefe ist wichtig für die Art der Aufzeichnung, die für das Experiment erforderlich ist (d. h. platzieren Sie die Elektroden über der Dura für EEG-Aufzeichnungen oder verwenden Sie stereotaktische Koordinaten für definierte Gehirnstrukturen).
- Tragen Sie großzügig Cyanacrylat auf die Basis des Senders auf, um den Bereich abzudecken, und achten Sie darauf, eine Beschichtung der Elektroden zu vermeiden. Cyanacrylatkleber ist ein elektrischer Isolator, die Kontamination der Elektroden mit Klebstoff führt zu keinem Signal.
- Wenn Sie aus tiefen Hirnstrukturen aufzeichnen, montieren Sie den Sender auf dem Kanülenhalter und platzieren Sie ihn in den stereotaktischen Arm zur Steuerung der Z-Achse. Senken Sie den Transmitter mit dem stereotaktischen Arm auf die entsprechende Tiefe ab und platzieren Sie Cyanacrylat-Gel um den Transmitter.
- Trocknen Sie den Schädel gründlich ab, bevor Sie den Sender platzieren, um eine starke Klebeverbindung zu gewährleisten. Tragen Sie den mit Cyanacrylat beschichteten Transmitter auf den Schädel auf. Achten Sie darauf, die Elektroden mit den entsprechenden Bohrlöchern auszurichten.
- Versuchen Sie, große Gefäßstrukturen nicht zu beschädigen. Halten Sie den Sender eine Minute lang mit leichtem Druck an Ort und Stelle. Üben Sie leichten Druck aus, um eine starke Verbindung zwischen dem Sender und dem Schädel herzustellen.
- Tragen Sie zusätzliches Cyanacrylat auf, genug, um die Schnittstelle zwischen Sender und Schädel vollständig abzudichten. Um eine gute Passform und einen starken Verbund zu gewährleisten, maximieren Sie die Oberfläche des Klebers, der mit dem Schädel in Kontakt kommt. Tragen Sie den Cyanacrylat-Kleber in einem Kreis um den Sender auf und achten Sie darauf, dass sowohl der Schädel als auch die Wand des Senders bedeckt sind.
- Tragen Sie den chemischen Beschleuniger (0,1 ml) durch eine Spritze um das Cyanacrylat an der Basis des implantierten Transmitters auf. Verwenden Sie den Beschleuniger sparsam und achten Sie darauf, ihn nicht auf benachbartes Gewebe aufzutragen.
Anmerkung: Die chemische Beschleunigung der Cyanacrylat-Härtung sorgt dafür, dass die starke Bindung zwischen dem Transmitter und dem Schädel schnell gebildet wird. Cyanacrylat-Beschleuniger ist nützlich, um die Aushärtung des Klebstoffs zu beschleunigen, aber nicht notwendig.
- Entfernen Sie den Brandbeschleuniger, indem Sie den Bereich gründlich mit steriler Kochsalzlösung waschen. Cyanacrylat-Beschleuniger kann Gewebereizungen verursachen, wenn er nicht aus dem Bereich des Einschnitts gewaschen wird. Um den Bereich zu waschen, füllen Sie eine 1,0-ml-Spritze mit steriler Kochsalzlösung und spülen Sie den Bereich durch eine Spritzennadel. In der Regel reichen 0,5 ml Kochsalzlösung aus, um den Beschleuniger auszuwaschen.
- Nähen Sie die Haut um die Basis des Senders, aber bedecken Sie den Sender nicht. Die Oberseite des Senders muss sich über der Haut befinden, um neuronale Signale effizient zu übertragen. Die Haut sollte um den Transmitter und den Kleber um das Gerät herum einigermaßen eng sein. Verwenden Sie Vicryl oder Seidennaht (weicher Faden); Die Haut unreifer Tiere ist weich und kann leicht beschädigt werden, wenn keine weichen Nähte verwendet werden. Verwenden Sie bei erwachsenen Tieren jegliches Nahtmaterial.
- Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es zur Genesung auf eine Heizdecke.
- Stellen Sie sicher, dass die Tiere warm (37 °C) und gehfähig (d. h. vollständig genesen) sind, bevor Sie zum Damm zurückkehren. Stellen Sie sicher, dass das Tier mit Feuchtigkeit versorgt ist, indem Sie die Haut auf dem Rücken des Tieres einklemmen (wenn das Tier dehydriert ist, bleibt die Haut deformiert). Wenn das Tier dehydriert ist, ist eine subkutane Injektion von Laktat-Ringer-Puffer zu verabreichen. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
- Verabreichen Sie den Tieren Buprenorphin (0,05 mg/kg) zur postoperativen Schmerzbehandlung und eine subkutane Injektion von 0,1 ml Bupivacain um die Injektionsstelle.
Anmerkung: Von Anfang bis Ende sollte der gesamte Eingriff bei Tieren dieses Alters in 5-10 Minuten abgeschlossen sein (postnataler Tag 6). Die Operationszeit kann bei älteren Tieren länger dauern.
>3. Pflege und Unterbringung
Hinweis: Einige Muttertiere tolerieren möglicherweise keine Jungtiere, die mit dem Gerät implantiert wurden. Möglicherweise müssen Muttertiere ausgewählt werden, die tolerant sind. Es ist akzeptabel, dass die Hündin die Jungtiere im Käfig bewegt, indem sie sie vom Sender aufnimmt.
- Sobald die Tiere entwöhnt sind, sollten Sie sie einzeln unterbringen, um zu vermeiden, dass die Geräte von ihrem Käfiggenossen entfernt werden.
- Tiere durch tödliche Dosis von Pentobarbital (25 mg/kg) oder Isofluran (in einer Glasglocke) einschläfern, wenn Anzeichen von Stress vorhanden sind.
- Hinweis: Einige Tierhaltungskäfige mit Drahteinsätzen können die implantierten Sender stören. Achten Sie darauf, die Höhe des Drahteinsatzes zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Tiere den Sender nicht zwischen den "Stangen" des Drahteinsatzes einklemmen können.
>4. EEG aufzeichnen
- Setzen Sie das Tier allein oder gemeinsam mit Wurfgeschwistern und der Hündin in einen Käfig. Setzen Sie jedoch nur ein implantiertes Tier in einen einzigen Käfig. Lassen Sie die Welpen nicht länger als 2 Stunden allein in der Aufnahmekammer. Überwachen Sie die Tiere auf Anzeichen von Stress und Dehydrierung.
- Schließen Sie das mitgelieferte Netzteil an die Empfängerbasis an und vergewissern Sie sich, dass die Betriebsanzeige leuchtet. Schließen Sie die Empfängerbasis über Bajonett-Neil-Concelman-Kabel (BNC) an ein Datenerfassungssystem an.
- Platzieren Sie den Tierkäfig auf dem Empfängersockel (Abbildung 1). Die Signalleuchte sollte aufleuchten und anzeigen, dass ein Sender erkannt wurde. Nun können Daten aufgezeichnet werden.
- Um Daten aufzuzeichnen, schließen Sie die Empfängerbasis an einen Analog-Digital-Wandler an, und schließen Sie den Wandler an einen Computer an (Abbildung 2).
- Stellen Sie die Abtastrate der Aufnahme ein. Stellen Sie sicher, dass die Daten ordnungsgemäß abgetastet werden. Wählen Sie für die Aufnahme eine Abtastrate von mindestens 250 Hz (500 Hz empfohlen) (Bandbreite des Senders beträgt 0,1-100 Hz).
- Speichern Sie digitalisierte Daten und analysieren Sie sie mit Signalverarbeitungssoftwarepaketen wie Matlab.
