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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Einrichtung zum Schneiden von Hirnschnitten
- Bereiten Sie eine Schneidlösung her, bestehend aus (mM) 125 Cholin-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-Glukose, gesättigt mit Carbogengas (95 % O2–5 % CO2) und einer künstlichen Liquor (aCSF)-Aufnahmelösung, bestehend aus (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-Glukose, gesättigt mit Carbogen. Lege die Schneidlösung auf Eis, um sie kalt zu halten.
- Frieren Sie ca. 400 ml der Schneidlösung ein und pürieren Sie sie mit 100 ml nicht gefrorener Schneidlösung, um eine Eisauflage zu erhalten. Blase mit Carbogen (95 % O2–5 % CO2) bei einem Durchfluss von ca. 0,5 l/min durch kleinkalibrige Rohre oder Sinterglas, um einen gleichmäßigen, aber sanften Blasenfluss zu erzeugen.
- Bereiten Sie ein 250-ml-Becherglas mit einem erhabenen Nylonnetzeinsatz vor, auf dem die Gehirnscheiben platziert werden. Füllen Sie das Netz mit aCSF, um das Netz um ca. 2 cm zu bedecken, und blasen Sie es mit Carbogen, wobei Sie darauf achten, dass die Blasen den Scheibenhaltebereich nicht direkt stören. Es ist auch wichtig, dass sich keine Luftblasen im Nylonnetz befinden, also entfernen Sie sie, falls vorhanden. Dies ist die Warmhaltekammer und wird bei RT (20 - 25 °C) gehalten.
- Ordnen Sie die Präparierinstrumente an, einschließlich einer großen Schere, einer kleinen Schere, kleinen und großen Mikrospateln sowie großen und kleinen Pinzetten, und kühlen Sie sie auf Eis. Legen Sie den Vibratome-Gewebeschneideblock auf Eis auf ein Quadrat Aluminiumfolie. Besorgen Sie sich 2 Stück 6 cm Filterpapier, eine einschneidige Rasierklinge und ein 25-ml-Becherglas, das ebenfalls mit der Schneidlösungsauflage gefüllt ist.
- Füllen Sie einen zweiten Behälter mit Eis, legen Sie ein Stück Seidenpapier auf das Eis und stellen Sie eine 12 cm große Kulturschale darauf. Die Kulturschale mit Schneidlösung, Eisbrei füllen und mit Carbogen besprühen. Dies ist der Behälter, in dem die Hirndissektion durchgeführt wird.
- Bereiten Sie das Vibratom vor. Nehmen Sie eine frische zweischneidige Rasierklinge (verwenden Sie jedes Mal eine frische Klinge) aus der Verpackung und besprühen Sie sie mit 80% Ethanol und dann mit entionisiertem Wasser. Schneiden Sie eine 3-ml-Transferpipette aus Kunststoff an der Stelle, an der sie sich zu verjüngen beginnt. Dies wird für den Transfer von Hirnschnitten verwendet. Biegen Sie eine 27 G Nadel an der Basis um ca. 45° und befestigen Sie sie an einer 1 ml Spritze. Dies wird verwendet, um Scheiben während des Schneidens zu manipulieren.
>2. Schneiden von Hirnschnitten
- Betäuben Sie eine Maus (P16-P18) mit 2% Isofluran oder einer lokal zugelassenen Methode. Nach der Induktion das Tier mit einer großen Schere enthaupten und den Kopf in die 12 cm große Kulturschale fallen lassen, in der sich Blasen befindende Schneidlösungsgülle. Die Gülle muss vollständig in den Kopf eintauchen, um eine schnelle Abkühlung zu gewährleisten.
- Halten Sie die Vorderseite des Kopfes mit einer Hand und schälen Sie die Haut und das Bindegewebe nach vorne in Richtung Nase. Mit der kleinen Schere wird das Bindegewebe durchtrennt, um den darunter liegenden Schädel freizulegen. Entfernen Sie dann die Muskeln, die über der dorsalen Seite des Schädels und des Halses liegen.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie zuerst die Vorderseite des Schädels mit der großen Pinzette sichern und dann mit der kleinen Schere zwei seitliche Schnitte durch den Knochen auf beiden Seiten des Foramen magnum machen (Abbildung 1, Schnitte mit A1 und A2 beschriftet).
- Machen Sie einen weiteren Schnitt zwischen den Augen (direkt vor dem Bregma) (Abbildung 1, Schnitt mit der Bezeichnung B), dann schneiden Sie vorsichtig entlang der sagittalen Naht nach vorne und reflektieren Sie die geschnittenen Schädelabschnitte, um das Gehirn freizulegen (Abbildung 1, Schnitt mit der Bezeichnung C).
- Mit dem kleinen Spatel das Gehirn herausschöpfen und auf eine Kulturschale legen. Achten Sie auf die Hirnnerven auf der unteren Seite des Gehirns, die durchtrennt werden müssen, dies kann mit dem kleineren Mikrospatel erfolgen. Übertragen Sie das Gehirn mit dem größeren Spatel in das 25-ml-Becherglas, das mit der Schneidlösungsaufschlämmung gefüllt ist.
- Vorbereitung der Gehirnhälfte für das Schneiden.
- Legen Sie ein Stück des 6 cm langen Filterpapiers auf den Boden einer frischen Kulturschale und füllen Sie es mit frischer Schneidlösung, Gülle und Blase. Positionieren Sie das Gehirn mit dem größeren Spatel mit der Bauchseite nach unten auf dem Filterpapier. Nehmen Sie eine neue und gereinigte einschneidige Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn, um das Kleinhirn zu entfernen, und machen Sie dann einen Schnitt entlang der Mittellinie, um das Gehirn in zwei Hemisphären zu teilen.
- Vorbereitung des Vibratom-Gewebeblocks.
- Nehmen Sie den gekühlten Vibratom-Gewebeblock, trocknen Sie die Oberfläche und geben Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber in die Mitte und verteilen Sie ihn gleichmäßig auf die ungefähre Größe des Gehirns. Verwenden Sie den kleinen Spatel, um eine der Gehirnhälften auf den großen Mikrospatel zu manipulieren, so dass die mediale Seite des Gehirns nach unten zeigt.
- Berühren Sie den Rand des Spatels an der Schnittstelle des Gehirns auf dem zweiten Stück Filterpapier, um so viel wie möglich von der Lösung zu entfernen. Schiebe das Gehirn mit dem kleineren Spatel vom größeren Spatel ab, um es auf den Kleber zu führen.
- Befestigen Sie den Schneidblock in der Vibrationskammer und füllen Sie die Kammer mit Schneidlösungsschlämme und Blase, um sicherzustellen, dass das Gehirn vollständig eingetaucht ist. Drehen Sie den Schneidblock so, dass die ventrale Seite des Gehirns der Klinge zugewandt ist.
- Das Gehirn aufschlitzen.
Anmerkung: Jedes Vibratom ist ein Unikat, befolgen Sie also die Anweisungen des Herstellers.
- Stellen Sie die Scheibendicke auf 450 μm ein und stellen Sie sicher, dass die Klinge vibriert, während sie sich mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,3 mm/s durch das Gehirn bewegt. Schneiden Sie das Gehirn von der ventralen Seite bis zur kortikalen Oberfläche vollständig durch, wodurch sagittale Schnitte des gesamten Gehirns entstehen, die für elektrophysiologische Aufzeichnungen verwendet werden können. Die Scheiben werden seitlich bis medial hergestellt und typischerweise können 3 - 4 Scheiben aus jeder Hemisphäre geschnitten werden.
- Wenn sich der Boden der Scheibe anhebt, drücken Sie die Scheibe mit der gebogenen 27-G-Nadel vorsichtig wieder nach unten. Wenn jede Scheibe geschnitten wird, bewegen Sie sie mit der Transferpipette auf die Plattform in der Haltekammer, wo sie bis zu 8 Stunden lang lebensfähig sind.
>3. Extrazelluläre Elektrophysiologie-Aufzeichnungen
- Montage der Scheibe in der Aufnahmekammer.
- Mit der Transferpipette wird ein Hirnschnitt in eine untergetauchte Aufnahmekammer gelegt, die mit aCSF durchblutet ist, der mit 1 - 2 ml/min fließt und auf 32 °C erhitzt wird. Das für die Aufzeichnungen verwendete aCSF unterscheidet sich von dem in der Haltekammer, da die Mg2+-Konzentration von 2 mM auf 4 mM erhöht wird.
- Befestigen Sie die Scheibe mit einer "Harfe" (halbrunder Edelstahl mit Nylonsträngen, die im Abstand von 2 - 3 mm quer gespannt sind). Platzieren Sie die Harfe so, dass die Stränge parallel zu CA1 verlaufen. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit der Perfusion auf 8 - 10 ml/min bei 32 °C.
- Unter einem Präpariermikroskop wird eine Stimulationselektrode und eine Aufzeichnungselektrode (Glaselektrode, gefüllt mit der aCSF-Aufnahmelösung) auf die Oberfläche des Stratum radiatum des CA1 gelegt (Abbildung 2A). Platzieren Sie zuerst die Stimulationselektrode und dann die Aufnahmeelektrode.
- Stimulieren Sie die Schaffer-Kollateralen mit einem Testimpuls von 120 - 150 μA und einer Dauer von 0,1 ms und beobachten Sie die resultierende Wellenform des exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP), um den Zustand der Scheibe zu bestimmen (Abbildung 2B). Die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise etwa 50 - 100 μm von der Schichtoberfläche entfernt in die Scheibe bewegt werden, um eine fEPSP-Aufzeichnung mit einem kleinen Faservolley und einer großen Amplitude zu erhalten. Die durch Schaffer-Sicherheiten evozierten fEPSPs sind stereotyp und stellen einen guten Indikator für die Gesundheit der Scheibe dar. Gesunde Slices weisen in der Regel ein Fiber-Volley-zu-fEPSP-Amplitudenverhältnis von weniger als 0,3 auf.
- Neupositionierung der Elektroden.
- Bewegen Sie die Stimulationselektrode mit einem Präpariermikroskop in die Mitte des Stratum oriens und bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode so nah wie möglich an die Aufzeichnungselektrode in die Pyramidenzellschicht, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise ca. 50 - 100 μm in die Scheibe geschoben werden, so dass die fEPSP-Ansprechamplitude auf den 120 - 150 μA Testimpuls ungefähr 1 mV beträgt.
- Erzeugung von γ Schwingungen.
- Um γ Schwingungen zu erzeugen, stimulieren Sie das Gewebe mit einem Zug von 20 x 0,1 ms Impulsen, die bei 200 Hz abgegeben werden. Dieser tetanische Stimulus kann reproduzierbare Reaktionen hervorrufen, wenn er alle 5 Minuten verabreicht wird.
- Verwenden Sie die folgenden Aufnahmeparameter.
- Skalieren Sie die Verstärkung des Ausgangssignals so, dass sie dem Eingangsspannungsbereich des Analog-Digital-Wandlers entspricht. Stellen Sie sicher, dass die maximal erwartete Signalauslenkung mindestens 30 % des Eingangsspannungsbereichs einnimmt. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Verstärkungen zu hoch einstellen, da die Signale übersteuert werden können. Die typische Bandbreite, die für Feldaufnahmen benötigt wird, beträgt 500 Hz mit AC-Kopplung bei 0,1 Hz, um Basisliniendrift zu vermeiden.
- Digitalisieren Sie mindestens 4 - 5 Mal schneller als die Eckfrequenz des Tiefpassfilters, um Signal-Aliasing zu vermeiden.
