Direkt gekoppeltes Elektroretinogramm Aufzeichnung des retinalen Pigmentepithels bei einer Maus

Zusammenfassung

Quelle: Miyagishima, K. J., et al. direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtevozierten elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Aufnahme eines direkt gekoppelten Elektroretinogramms (DC-ERG) auf einem dunkeladaptierten, anästhesierten retinalen Pigmentepithel (RPE) der Maus. Nach dem Auftragen von dilatierenden Tropfen wird das Tier in eine Aufnahmeeinrichtung gebracht und die mit einem Salzpuffer gefüllte Kapillarelektrode auf die Hornhaut gelegt. Nach der Festlegung der Baseline wird DC-ERG aufgezeichnet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Maus- und Elektrodenpositionierung

1. Bewahren Sie die Mäuse über Nacht in einer gut belüfteten, lichtdichten Box auf, damit sie sich an die Dunkelheit gewöhnen können.
2. Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (8 mg/kg) anästhesiert.
3. Tragen Sie einen Tropfen 0,5 % Proparacain-HCl topisch auf, um die Hornhaut zu betäuben, sowie einen Tropfen 2,5 % Phenylephrin-HCl und 0,5 % Tropicamid, um die Pupillen zu erweitern.
4. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Maus mit einer Schere ab, um zu verhindern, dass unbeabsichtigtes Zucken die Glaskapillarelektroden während der Aufnahme stört.
   Anmerkung: Das Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) Stimulusprotokoll innerhalb des ERG-Systems verfügt über mehrere integrierte Stimulusroutinen, die durch Klicken auf Step (Vorwärtspfeil) oder Step (Rückwärtspfeil) ausgewählt werden können. Es sind nur die Schritte 1, 4 und 5 in der Software erforderlich, um die DC-ERG-Aufzeichnung vorzubereiten und durchzuführen.
5. Im ERG-System überprüft die Software, ob der richtige Patient ausgewählt wurde. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Protokolle. Wählen Sie unter Protokollbeschreibung die Option DC-ERG aus. Klicken Sie dann auf Ausführen. Vergewissern Sie sich, dass dies der richtige Test ist, indem Sie auf Ja klicken.
6. Verwenden Sie Schritt 1/6 mit dem Stimulus "Rotes Licht", um das rote Licht in der Kuppel einzuschalten, um die Maus und die Elektroden zu positionieren und gleichzeitig die Änderungen der Impedanz zu beobachten.
7. Legen Sie die Maus auf einen beheizten Aufnahmetisch und halten Sie die Haut des hinteren Beins vorsichtig mit einer Pinzette fest. Halten Sie die Nadelelektrode fest in einer Hand und führen Sie sie subkutan in das hintere Bein ein, um sie zu fixieren.
8. Platzieren Sie die Referenzelektrode Silber/Siverchlorid (Ag/AgCl) (Materialtabelle) so in den Mund, dass das gesinterte Pellet entlang der hinteren Wange aufliegt und hinter den Zähnen an Ort und Stelle gehalten wird.
   Anmerkung: Golddrahtelektroden sollten nicht als Mundreferenzelektrode verwendet werden, da sie unterschiedliche Impedanzeigenschaften aufweisen und das Spitze-zu-Spitze-Rauschen erhöhen.
9. Halten Sie vor dem Platzieren der Kapillarelektroden am Auge der Maus den Elektrodenhalter mit den Glaskapillaren senkrecht und schnippen Sie mit dem Zeigefinger über den Elektrodenhalter, um eventuell eingebrachte Blasen zu entfernen. Füllen Sie die Spitze mit einer 25-G-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) und prüfen Sie, ob an der Spitze keine Luftblase eingeschlossen ist. Positionieren Sie das Elektrodenhalterstativ so, dass die offene Spitze der HBSS-gefüllten Kapillaren in sanftem Kontakt mit der Hornhaut steht.
10. Wenden Sie besondere Vorsichtsmaßnahmen an, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, indem Sie den Gleitgelspender für Augen umgedreht halten und die ersten Tropfen entsorgen. Geben Sie einen Tropfen Gleitgel auf jedes Auge, um die Leitfähigkeit zu erhalten und ein Austrocknen während der Aufnahme zu verhindern.

>2. DC-ERG-Aufnahme

1. Klicken Sie auf Step (Pfeil nach vorne), um Step 4/6 "Long Flash No-Li" auszuwählen.
2. Klicken Sie auf Impedanz. Verwenden Sie den Bildschirm Impedanzprüfung, um die Widerstände des linken und rechten Auges zu untersuchen. Es wird erwartet, dass die Impedanzwerte für die Aufzeichnungselektroden an jedem Auge ähnlich sind (~39 kΩ). Die Impedanzwerte für die Masse und die Referenzelektroden werden voraussichtlich weniger als 10 kΩ betragen.
3. Klicken Sie auf Vorschau, um die Spuren für das linke und rechte Auge anzuzeigen. Warten Sie, bis ein stabiler Ausgangswert erreicht ist (<10 Minuten). Klicken Sie auf Stopp, um die Trace-Vorschau zu verlassen.
   Anmerkung: Abrupte Änderungen der Driftrichtung oder abweichendes Rauschen in der Aufnahme werden sich mit der Zeit nicht verbessern und erfordern die Identifizierung der Kapillarelektrode, die Aufmerksamkeit erfordert. Die wahrscheinlichste Ursache ist eine Blase, die an die Spitze der Elektrode eingeführt wird. Füllen Sie die Spitze wieder mit HBSS auf. Klicken Sie erneut auf Vorschau, um die Baseline zu überprüfen.
4. Klicken Sie auf Step (Pfeil nach vorne), um Step 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min" auszuwählen. Klicken Sie auf Run, um die Aufnahme zu starten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ag/AgCl (Mund) Elektrode	WPI Inc	Folge 1	Mund-Referenzelektrode für Maus
Keramische Fliesen	Sutter-Instrument	cts	Wird verwendet, um das Glaskapillarrohr auf eine geeignete Größe zu schneiden
Reinigungsstab mit Baumwollspitze	Puritanische Medizinprodukte	867-WC Ohne Kleber	Zur Verwendung als Abstandshalter zur Verbesserung der Passform der Elektrodenhalterbaugruppe
Elektroretinogramm (ERG) System	Diagnosys GmbH	E3-System	Visuelles Elektrophysiologiesystem zur Diagnose von Augenerkrankungen in der Sehforschung und in Arzneimittelstudien
Bunsenbrenner	Argos Technologien	BW20002460	Oder gleichwertig zum Formen von Glas unter Flamme
Glas-Kapillarrohr (1,5 mm)	Sutter Instrumente	BF150-75	Zum Befüllen mit HBSS und zum Kontakt mit der Hornhaut
Hank's gepufferte Salzlösung (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	Tel.: 14175-095	handelsüblich. Pflegen bei RT
Inline-Filter	Whatman	Tel.: 6722-5001	Zum Schutz der Vakuumpumpe vor Aerosolen
Geräuscharmes Kabel für Mikroelektrodenhalter	WPI Inc	Nr. 5372	Empfohlen zur Verbesserung der Länge und Platzierung der Kabel und Elektrodenhalterbaugruppen
Magnetisches Kugelgelenk	WPI Inc	500871	Zum magnetischen Positionieren der Elektrodenhalterbaugruppe auf dem Tisch
MatLab (Englisch)	Mathworks (Englisch)		MatLab: Für die Bearbeitung der Analysesoftware
Matlab Curvefit Werkzeugkasten	Mathworks (Englisch)		Toolbox für MatLab (wird nur für die Bearbeitung der Analysesoftware benötigt)
MatLab-Compiler	Mathworks (Englisch)		Toolbox für MatLab (wird nur für die Bearbeitung und erneute Freigabe der Analysesoftware benötigt)
MatLab Runtime Version 9.5	Mathworks (Englisch)	Nr. R2018b (9.5)	Erforderlich, um die Analysesoftware auszuführen: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Mikroelektrodenhalter (45 Grad)	WPI Inc	MEH345-15	Zum Halten der Kapillaren
Nadel (25 ga)	Covidien	8881250313	Zum Befüllen der Kapillarröhrchen mit HBSS
Nadel-(Masse-)Elektrode	Rhythmus-Link	13mm - ein Elctrode	Subdermale Nadelelektrode (geerdet) für Maus (13 mm lange Nadel mit 0,4 mm Durchmesser, 1,5 m Elektrodendraht)
Regler/Power Conditioner	Furman	P-1800	Oder gleichwertig, um den DC-Offset von Rauschen zu entfernen, das über die Stromleitung eingeleitet wird
Spritze (12 mL)	Monojekt	1181200777	Zum Befüllen der Kapillarröhrchen mit HBSS
T-Clip	Cole-Parmer	Tel.: 06852-20	Für die Montage von Elektrodenhaltern
Vakuum-Exsikkator	Bel-Kunst	Artikel-Nr.: 420120000	Boden und Abdeckung aus klarem Polycarbonat
Pharmakologische Behandlung
Gleitgel für die Augen	Alcon	Tel.: 0078-0429-47	Hilft bei der Schmierung der Hornhautoberfläche und hält den elektrischen Kontakt mit den Kapillarelektroden aufrecht
Phenylephrinhydrochlorid 2,5%	Akorn	Artikel-Nr.: 17478-201-15	Kurz wirkende mydriatische Augentropfen (zur Pupillenerweiterung)
Proparacainhydrochlorid 0,5%	Akorn	Artikel-Nr.: 17478-263-12	Lokalanästhetikum zur ophthalmologischen Instillation
Tropicamid 0,5 %	Akorn	Artikel-Nr.: 17478-101-12	Kurz wirkende mydriatische Augentropfen (zur Pupillenerweiterung)
Xylazin	AnaSed	sc-362949Rx	Analgetikum und Muskelrelaxans
Zetamin (Ketamin HCl)	VetOne	501072	Anästhetikum für intramuskuläre Injektionen