Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Drosophila sensilla als Reaktion auf flüchtige Geruchsstoffe

Zusammenfassung

Quelle: Ng, R., et al. Elektrophysiologische Aufzeichnung von Drosophila Trichoid sensilla als Reaktion auf Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit. J. Vis. Exp. (2017).

In diesem Video wird eine lebende Drosophila-Fliege für elektrophysiologische Untersuchungen in eine Röhre montiert. Elektroden werden an der Basis des Sensillums positioniert, um spezifische neuronale Reaktionen auf Pheromone mit den Geruchsrezeptorneuronen der Fliege aufzuzeichnen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Hardware für die at4-Aufnahme

1. Verwenden Sie ein Pipettenabzieher-Instrument, um Elektroden mit Aluminiumsilikatglaskapillaren (AD 1,0 mm, ID 0,64 mm) vorzubereiten. Stumpfen Sie die Spitze der Referenzelektrode leicht mit einer feinen Pinzette, um das Einführen in den Clypeus der Fliege zu erleichtern (d. h. eine abgerundete Platte an der Vorderseite des Fliegenkopfes, über den Mundwerkzeugen).
   HINWEIS: In dieser Studie wurden 7 Tage alte WT (Wildtyp) Männchen (Berlin) verwendet. Verwenden Sie AHL-Kochsalzlösung als Elektrolyt für beide Elektroden.
2. Bereiten Sie 1 l AHL (Adulte Hämolymphe) vor, indem Sie 900 ml destilliertes Wasser mit 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCO₃, 0,1120 g NaH₂PO₄, 1,892 g Trehalose ּ2H₂O, 3,423 g Saccharose, 1,192 g HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) mischen. und 8,2 mL 1M MgCl₂. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 1 l. Bringen Sie den pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,4 und sterilisieren Sie die Lösung mit einem vakuumbetriebenen Filtersystem. Für die Langzeitlagerung halten Sie die AHL-Aliquots bei 4 °C.
   HINWEIS: Konsistente Lieferungen von Palmitoleinsäure hängen von der Gleichmäßigkeit zwischen den Patronen ab. Jede Kartusche muss reproduzierbar zusammengebaut werden.
3. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge 0,9 cm von der Spitze einer 200-μl-Pipettenspitze, um den ersten Kartuschenabschnitt mit einer Länge von 4,1 cm zu erhalten; beziehen Sie sich auf die in Abbildung 1A angegebenen Abmessungen. Verwenden Sie eine weitere 200-μl-Pipettenspitze und entfernen Sie 1,7 cm und 1,5 cm von der Spitze und dem Boden, um den zweiten Kartuschenabschnitt zu erstellen. mit einer Länge von 1,8 cm (Abbildung 1A). Verwenden Sie ein Lineal, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
4. Verwenden Sie einen 1/8-Zoll-Locher, um Scheiben aus Filterpapier zu schneiden.
5. Platzieren Sie mit einer Pinzette eine Filterpapierscheibe an der Spitze des zweiten Patronenabschnitts. Vergewissern Sie sich visuell einer Öffnung in der Patronenspitze, durch die Luft strömen kann.
6. Bringen Sie den ersten und zweiten Patronenabschnitt an, wie in Abbildung 1A gezeigt. Winkeln Sie den zweiten Patronenabschnitt nach unten an, um das quadratische Zielen auf die Vorbereitung zu erleichtern (Abbildung 1B).
7. Verbinden Sie die Kartusche mit dem Geruchsabgaberohr, das an einem Mikromanipulator montiert ist.
   HINWEIS: Durch diese Konstruktion kann die Kartusche nach außen geschwenkt werden, um den Austausch zu erleichtern (Abbildung 1C).
8. Stellen Sie den konstanten befeuchteten Luftstrom in einem Massenregler auf 2 l/min und den Odormittelstrom auf 500 mL/min in einem anderen Massenregler ein.
9. Programmieren Sie mit der Software (siehe Materialtabelle) das Verfahren zur Verabreichung eines 500-ms-Geruchspuffs.

2. Vorbereitung von Palmitoleinsäure-Odorierlösungen für die Abgabe

HINWEIS: Or47b ORNs reagieren sowohl auf cis- als auch auf trans-Palmitoleinsäure. Da Palmitoleinsäure bei RT instabil ist, werden die Bestände bei -20 °C gelagert und innerhalb eines Monats nach dem Öffnen verbraucht. Ethanol ist das Lösungsmittel der Wahl für Palmitoleinsäure.

1. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um 10 μl cis- oder trans-Palmitoleinsäure-Aktien oder -Verdünnungen gründlich mit 90 μl 100 % Ethanol für zehnfache Serienverdünnungen in 1,7-ml-Mikroröhrchen zu mischen. Bereiten Sie täglich vor den Versuchen frische Palmitoleinsäureverdünnungen vor und verwenden Sie sie innerhalb eines Tages.
   HINWEIS: Für Odorstoffe, die nicht in Ethanol löslich sind, wird ein Glasfläschchen empfohlen, um Geruchsverdünnungen mit anderen Arten von organischen Lösungsmitteln herzustellen.
2. Tragen Sie mit einer P10-Mikropipette 5 μl cis-Palmitoleinsäure-Lösungen der gewünschten Verdünnungen auf das Filterpapier in jeder entsprechenden Patrone auf.
   HINWEIS: Die höchste Dosierung (^10-1) enthält 450 μg der Verbindung. Bei Trans-Palmitoleinsäure-Lösungen ist stattdessen 4,5 μl zu geben, so dass die höchste Dosierung (^10-1 ) 450 μg der Verbindung enthält.
3. Legen Sie die Palmitoleinsäure-Patronen für 1 h bei RT und 7,59 mmHg Druck in einen Vakuum-Exsikkator, um das Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.
   HINWEIS: Die Patronen können bis zu 4 h bei RT verwendet werden.

3. Vorbereitung von Drosophila für den sofortigen Zugang zur at4 Sensilla für elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnungen

HINWEIS: WT-Fliegen (Berlin) werden in Standard-Maismehlmedium bei 25°C in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 aufgezogen. Bei der Eklosion werden die Fliegen nach Geschlecht in Zehnergruppen eingeteilt, wobei sie bis zum Alter von 7 Tagen in Gruppen untergebracht werden. Or47b ORNs (Olfactory Receptor Neurons) reagieren sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Fliegen auf Palmitoleinsäure. Der Einfachheit halber werden in der aktuellen Studie nur männliche Fliegen untersucht.

1. Bauen Sie eine Fliegenpräparate zusammen: Legen Sie auf einen Glasobjektträger ein Glasdeckglas (18 x 18 mm2) auf eine kleine Menge Modelliermasse und bilden Sie einen ~3°-Winkel mit dem Glasobjektträger. Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die Innenkante des Deckglases und den Bereich des Objektträgers direkt darunter. Ersetzen Sie es durch frisches Band für jeden Tag der Aufzeichnung (Abbildung 2A).
2. Verwenden Sie einen Fliegensauger15, um die gewünschte Fliege im Schlauch zu sammeln, und setzen Sie dann eine 200-μl-Pipettenspitze über das Ende des Schlauchs. Schieben Sie gleichzeitig den Schlauch nach vorne, während Sie Luft hineinblasen, um den Flügel an das Ende der Pipettenspitze zu drücken. Schneide mit einer Rasierklinge knapp unter dem Körper der Fliege und 2 Kopflängen über der Fliege.
3. Stampfen Sie die Unterseite der Pipettenspitze mit Modelliermasse an und schieben Sie die Fliege nach oben, bis sowohl die Antennen als auch der Clypeus freigelegt sind (Abbildung 2B). Um die Fliege nicht zu töten, füge nur so viel Lehm hinzu, dass die Fühler und Arista freigelegt werden, da dies verhindert, dass der Hinterleib der Fliege zerquetscht wird. Darüber hinaus sollten Sie die Tonerde langsam und vorsichtig hinzufügen, um eine plötzliche Verengung zu vermeiden. Vergewissern Sie sich, dass die Fliege am Leben ist, indem Sie auf Fühler- oder Rüsselbewegungen prüfen.
4. Benutze eine Pinzette, um die Pipettenspitze zu manövrieren, in der sich die Fliege befindet. Richten Sie den Kopf so aus, dass der Clypeus zur Rechten des Betrachters zeigt. Passen Sie die Vorbereitung mit einer feinen Pinzette entlang des Deckglases an, bis die seitliche Seite der Antenne auf der abgeklebten Deckglasoberfläche aufliegt (Abbildung 2B).
5. Platzieren Sie eine Haltestange auf der Arista, um die Antenne an dem doppelseitigen Klebeband zu befestigen und eine Bewegung zu verhindern (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Die Haltestange wird mit einem Pipettenabzieher aus einer Kapillare aus Borosilikatglas gezogen und mit Modelliermasse in Position gehalten (Abbildung 2A).
6. Platzieren Sie die Vorbereitung auf der Bühne des Rigs (Abbildung 2C). Bestätigen Sie mit dem Mikroskop, dass das Trichoid entlang des distal-lateralen Randes des dritten Segments der Antenne sichtbar ist.
   HINWEIS: Die Silhouette der Sensilla sollte sich vom Hintergrund abheben, um ihre Identifizierung zu vereinfachen und die Aufnahme zu erleichtern (Abbildung 3). In diesem Präparat sind die am leichtesten zugänglichen tricchoide Sensillen vom at4-Typ.
7. Wie zuvor beschrieben, halten 2, 15 die Vorbereitung unter konstantem befeuchteten Luftstrom (2 l/min), der über einen separaten Luftzufuhrschlauch etwa 2 cm von der Vorbereitung entfernt abgegeben wird (Abbildung 4).

4. Aufzeichnung der at4-Sensillum-Aktivität von Or47b-ORNs in den at4-Trichoiden als Reaktion auf Palmitoleinsäure

1. Führen Sie die Referenzelektrode in den Clypeus ein (Abbildung 3A). Stellen Sie mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung sicher, dass die Elektrode direkt unter der Oberfläche eingeführt wird, wo sie die Hämolymphe unter der Nagelhaut berühren kann, um Gewebeschäden zu vermeiden.
2. Senken Sie die Aufzeichnungselektrode langsam ab, bis sie in die gleiche Ansichtsebene wie das Zielsensillum eintritt (Abbildung 3B). Aufnahme unter einem 50-fach-Objektiv.
   Anmerkung: Die zähe trichoide Kutikula erfordert das Einführen der Aufzeichnungselektrode in die Sensillarbasis, deren breiterer Bereich ein größeres Ziel bietet, das die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die Elektrode abgelenkt wird (Abbildung 3B, Einschub).
3. Bevor Sie Geruchsreize auf ein Sensillum anwenden, beachten Sie die folgenden Auswahlkriterien: Jedes Trichoide, das diese Standards nicht erfüllt, sollte abgelehnt und stattdessen ein anderes Sensillum gewählt werden.
   1. Es ist ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu beobachten (siehe Abbildung 3C für ein Beispiel).
   2. Beobachten Sie identifizierbare Spikes von at4A- und at4C-Neuronen (Abbildung 3C).
      HINWEIS: Die Spike-Amplitude von at4B scheint der von at4A10 sehr ähnlich zu sein und kann ohne Geruchsstimulation nicht leicht identifiziert werden.
   3. Es ist zu beachten, dass die basale Feuerrate der at4A-Neuronen bei oder unter 20 Hz liegt.
      HINWEIS: Dieses Kriterium ist spezifisch für at4A, da die basale Feuerrate für das Neuron höher ist als die der basikonischen ORNs. Ein viel höheres basales Feuern deutet darauf hin, dass die Neuronen während des Elektrodeneinschubs beschädigt worden sein könnten.
4. Schließen Sie die Kartusche an das Odormittelabgaberohr an. Beginnen Sie mit der Lösungsmittelkontrolle und dann mit den Odoriermitteln, von niedrigen bis zu hohen Konzentrationen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Patrone in Richtung Vorbereitung zu manövrieren, während Sie die Patrone direkt auf den Kopf der Vorbereitung richten. Vergewissern Sie sich visuell, dass die Patrone aus einigen Millimetern Entfernung direkt auf die Antenne gerichtet ist (Abbildung 4).
   HINWEIS: Ziel ist es, die Öffnung der Patrone direkt an der Antenne auszurichten und sie in der Nähe des Zielgewebes zu positionieren.
5. Es ist darauf zu achten, dass die Odorierkartusche von der Aufzeichnungselektrode auf der rechten Seite um 1 - 2 mm und von der darunter liegenden Fliegenvorbereitungsschiene ca. 1 mm getrennt ist.
   Anmerkung: In dem hier beschriebenen Aufbau wird die Odoriermittelpatrone eng von der Aufzeichnungselektrode, der Referenzelektrode und dem Fly-Prep-Objektträger begrenzt (Abbildung 4).
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie den Abstand zwischen der Tonabnehmer und den Aufzeichnungs-/Referenzelektroden. Empfohlen wird ein Abstand von ca. 4 mm. Ein unbeabsichtigter Kontakt kann das Signal beenden und die Spitze der Aufzeichnungselektrode brechen, wodurch das aktuelle Neuron beschädigt und weitere Aufzeichnungen erschwert werden.
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie den Abstand zwischen der Kartusche und dem Fly-Prep-Schlitten. Das Berühren des Deckglases kann auch dazu führen, dass sich die Aufnahmeelektrode löst und die Aufnahme unterbrochen wird.
6. Drücken Sie in der Datenerfassungssoftware auf "Aufnehmen", um die Aufnahme zu starten.
   HINWEIS: Für jede 10-s-Aufnahme wird ein einzelner Geruchsimpuls von 500 ms direkt an die Antenne abgegeben, wie in Schritt 1.9 beschrieben.
7. Ziehen Sie die Kartusche nach dem Auftragen des Odoriermittels vorsichtig zurück, bevor Sie sie durch eine Kartusche mit der nächsthöheren Konzentration ersetzen. Fahren Sie fort, bis der gesamte Dosierungsbereich erreicht ist.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, von jeder Fliege nur eine Or47b ORN aufzuzeichnen, um mögliche Anpassungseffekte zu vermeiden.
8. Spülen Sie die Aufnahmeelektrode nach Beendigung der Aufnahme für den Tag gründlich mit destilliertem Wasser ab.
9. Analysieren und plotten Sie die Daten mit kommerziell erhältlicher Offline-Analysesoftware.

Ergebnisse

Abbildung 1: Einrichtung der Kartusche und des Olfaktometers. (A) Vorbereitung von Geruchspatronen. Von links nach rechts: eine Standard-Pipettenspitze mit einem Fassungsvermögen von 200 μl, der erste und zweite Kartuschenteil sowie eine fertige Odorierkartusche. (B) Die Kartusche, die mit dem Olfaktometer verbunden ist und die Abwärtsneigung des zweiten Abschnitts zeigt. (C) Olfaktometeraufbau, der das auf dem Mi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vorbereitung Setup & Sonstige Materialien
Pipettenabzieher-Instrument	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	Seite 97	Pipetten-Abzieher
Kapillaren aus Borosilikatglas	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	1B100F-4	zur Herstellung von Haltestangen
Kapillaren aus Aluminiumsilikatglas	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	Nr. AF100-64-10	zur Herstellung von Elektroden
Superfrost Objektträger	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	Tel.: 12-550-143	für Fly-Prep Station
Permanentes doppelseitiges Klebeband	Scotch St. Paul, MN USA	Na	für Fly-Prep Station
Aufrechtes Mikroskop	Olympus, Shinjuku, Tokio, Japan	BX51	für Aufnahme-Rig
Plastalina Modelliermasse	Van Aken, North Charleston, SC, Vereinigte Staaten von Amerika	B0019QZMQQ	für die Vorbereitungsstation und zum Stabilisieren der Haltestange
Sterile Einweg-Filtereinheit mit schnellem Durchfluss und SFCA-Membran, 0,45 mm	Nalgene, Rochester NY Vereinigte Staaten von Amerika	#156-4045	zur Sterilisation von AHL-Lösung
200 μL Pipettenspitze	VWR Radnor, PA USA	Tel.: 53508-810	zur Herstellung von Geruchspatronen und zur Fliegenvorbereitung
Filterpapier	Whatman, Maidstone, Kent, Großbritannien	740-E	zur Herstellung von Geruchspatronen
Vakuum-Exsikkator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	Nr. VX-06514-30	zum Verdampfen von Ethanollösungsmitteln
cis-Palmitoleinsäure	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b Odorant
trans-Palmitoleinsäure	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b Odorant
Ethanol	Spectrum Chemical MFG. New Brunswick, NJ Vereinigte Staaten von Amerika	E1028-500MLGL	zur Verdünnung von Palmitoleinsäure
Mikromanipulator für Odormittelkartusche	Siskiyou, Grants Pass ODER USA	MX130R	So positionieren Sie das Olfaktometer
Flow Vision Software	Alicat, Tuscon AZ USA	FLOWVISIONSC	Software zur Steuerung der Durchflussmenge
Massenregler	Alicat, Tuscon AZ USA	MC-2SLPM-D	zur Steuerung der Durchflussmenge für befeuchtete Luft
Massenregler	Alicat, Tuscon AZ USA	MC-500SCCM-D	zur Steuerung der Durchflussrate zur Geruchsstimulation
Clampex	Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA	Ver. 10.4	Software zur Datenerfassung
Luftförderrohr	Ace Glass, Vineland, NJ USA	Tel.: 8802-936	zur Abgabe von befeuchteter Luft
50X Objektiv	Olympus, Shinjuku, Tokio, Japan	LMPLFL50X	Aufnahme-Rig
Klemme 10	Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA	Ver. 10.4	Software für die Spike-Analyse
Igor Pro 6	WaveMetrics, Lake Oswego ODER USA	Ver. 6.37	Software zur Datenanalyse
Audio-Monitor	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, USA	NPIEXB-AUDIS-08B	Meldet akustisch einzelne Spitzen
Extrazellulärer Verstärker	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, USA	NPIEXT-02F	zur Erhöhung der Amplitude elektrischer Signale
Ventil-Regler	Warner Instruments	VC-8	zur Steuerung der Öffnung des Ventils zur Geruchsstimulation
Mikromanipulator für Aufnahmeelektroden	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	MP-285	zur Positionierung der Aufzeichnungselektrode
Headstage-Verstärker	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, USA	EQ-16.0008	zur Erhöhung der Amplitude elektrischer Signale
Oszilloskop	Tektronix, Beaverton ODER USA	TDS2000C	Visueller Bericht über einzelne Spikes