Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und postsynaptische Stromaufzeichnungen in einer Keilscheibe des Maus-Gehirns

Zusammenfassung

Quelle: Fischl, M. J., et al. In Vitro Keilscheibenvorbereitung zur Nachahmung der Konnektivität neuronaler Schaltkreise in vivo. J. Vis.(2020)

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und zur Aufzeichnung postsynaptischer Ströme in medialen olivocochlären Neuronen in Keilschnitten des Mausgehirns.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Aufbau und Aufzeichnung der Elektrophysiologie

1. Platzieren Sie die Wedge-Slice in der Aufnahmekammer und sichern Sie die Slice mit einer Harfe oder einem Stabilisierungssystem. Perfundieren Sie das Gewebe kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 7-10 ml/min mit warmem (35 °C) ACSF, das mit Karbogen blasiert ist.
2. Identifizierung genetisch markierter medialer olivocochlederer MOC-Neuronen im ventralen Kern des trapezförmigen Körpers VNTB mittels Epifluoreszenz mit 561 nm Emissionsfiltern für Patch-Clamp-Aufnahmen. Slice spiegeln, wenn keine potenziell patchbaren Zellen vorhanden sind.
3. Fokussieren Sie sich mit einer DIC-Optik auf die Hörnervenwurzel an der dicken Seite der Scheibe und bewegen Sie die bipolare Wolfram-Stimulationselektrode mit einem Mikromanipulator nach unten zur Hörnervenwurzel und sanft in die Oberfläche des Gewebes.
   Anmerkung: Saugelektroden wurden in anderen Labors bei Experimenten zur Hörnervenstimulation eingesetzt. Theta-Glaselektroden oder optische Stimulationsverfahren können gegebenenfalls auch für andere spezifische Präparate eingesetzt werden.
4. Verschieben Sie das Sichtfeld zurück auf die VNTB, um ein MOC-Neuron auszuwählen, das für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie anvisiert werden soll.
5. Füllen Sie eine Aufnahmepipette mit einer geeigneten internen Lösung für das vorgeschlagene Experiment.
6. Patchen und Aufzeichnen aus dem MOC-Neuron in der Ganzzellkonfiguration. Kompensieren Sie bei Bedarf die Membrankapazität und den Serienwiderstand.
7. Passen Sie die elektrische Stimulationsamplitude der auditorischen Nervenwurzel an, um konsistente postsynaptische Ereignisse im MOC-Neuron zu erhalten.
   Anmerkung: Es kann notwendig sein, die Stimulationselektrode zu bewegen.
8. Führen Sie geeignete Stimulationsprotokolle durch, um evozierte synaptische Ströme in MOC (Voltage Clamp) zu beobachten.
   Anmerkung: Die Keilscheibenvorbereitung kann mit allen typischen Patch-Clamp-Werkzeugen verwendet werden, wie z. B. Loose Patch Recordings, Pharmakologie, Optogenetik, Calcium-Bildgebung, Neurotransmitter-Uncaging usw.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A1R aufrechtes konfokales Mikroskop	Nikon Instrumente		Elektrophysiologie und bildgebendes Mikroskop, kann jedes Mikroskop sein, das mit der Elektrophysiologie kompatibel ist
Elektrode Borosilikatglas mit Filament AD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm lang	Sutter-Instrument	BF150-110-10	Patch-Klemmung Pipette Glas
Elektroden-Füller MicroFil	WPI	CMF20G	Patch-Elektroden-Pipettenfüller
Inline-Lösungsheizung	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Heizung für Scheibenperfusionssystem
Multi-Mikromanipulator-Systeme	Sutter Instrumente	MPC-200 mit MP285	Mikromanipulatoren für Patch-Clamp und Stimulationselektrodenplatzierung
P-1000 horizontaler Pipettenabzieher für Mikropipetten aus Glas	Sutter-Instrumente	FG-P1000	Patch-Klemme Pipettierer Abzieher
Patch-Clamp-Verstärker und Software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Weiter	Kann jeder Verstärker/jede Software sein
Aufnahmekammer	Warner Instruments	RC26G	Scheibenbad während der Aufnahme
Aufnahme Kammerharfe	Warner Instruments	640253	Stabilisiert die Schicht während der elektrophysiologischen Aufzeichnung
Scheiben-Inkubationskammer	Sonderanfertigung		Beheizte, sauerstoffhaltige Haltekammer für Scheiben während der Auffrischung nach dem Schneiden
Stimulus-Isolationseinheit	A.M.P.I.	Iso-Flex	Stimulus-Isolationseinheit für die Elektrophysiologie
Spritze 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	Tel.: 14-820-11	Elektrophysiologie Handhabung von Perfusionsflüssigkeiten
Temperaturregler	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Temperaturregler für das Schichtperfusionssystem
Schlauch 1/8 AD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	Tel.: 14-171-129	Elektrophysiologie Handhabung von Perfusionsflüssigkeiten
Tugsten konzentrische bipolare Mikroelektrode	WPI	TM33CCINS	Stimulationselektrode für die Elektrophysiologie