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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Aufzeichnung von synaptischen CA3-CA1-Antworten
HINWEIS: Der elektrophysiologische Aufbau, der für die Feldpotentialaufzeichnung verwendet wird, ist in Abbildung 1A dargestellt. Ein Faradayscher Käfig wird dringend empfohlen, wenn die elektrischen Störungen nach der ordnungsgemäßen Erdung der elektrischen Einstellungen außerhalb der Kontrolle liegen. Viele verschiedene Arten von Tauch- und Grenzflächenkammern sind im Handel erhältlich. Grenzflächenkammern werden jedoch bevorzugt, da die Schnitte in ihnen robustere synaptische Reaktionen aufweisen.
- Positionierung der Elektroden
- Schalten Sie die zu verwendenden elektrischen Geräte (Stimulatoren und Verstärker) ein. Montieren und fixieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden in den Plexiglashaltern der Mikromanipulatoren.
Anmerkung: Wir verwenden monopolare, lackbeschichtete Edelstahlelektroden mit einem Widerstand von 5 MΩ sowohl für Stimulations- als auch für Aufnahmezwecke.
- Führen Sie diese Elektroden vor dem Gebrauch in die gezogenen Glaskapillaren ein und befestigen Sie sie mit Epoxidkleber, so dass nur ein kleiner Teil der Elektrodenspitze freigelegt wird (Abbildung 1E). Dies verleiht den sonst schlanken Elektroden Festigkeit und hilft, sie fest in den Elektrodenhaltern zu befestigen.
- Positionieren Sie unter dem Mikroskop die Stimulationselektrode(n) im Stratum radiatum der CA1-Region, um die Schaffer-Kollateralfasern zu stimulieren, und die Aufzeichnungselektrode in der apikalen dendritischen Region von CA1, um Feld-EPSP (fEPSP)-Reaktionen aufzuzeichnen.
Anmerkung: Wenn Sie sich mit den Elektroden der Flüssigkeitsoberfläche über der Scheibe nähern, erhalten Sie einen Klang, der hilft, die Oberfläche der Scheibe schnell zu lokalisieren (vorausgesetzt, der Verstärker ist an einen Lautsprecher angeschlossen).
- Bei synaptischen Tagging- und Capture-Experimenten werden je nach Bedarf des Experiments zwei oder drei stimulierende Elektroden (S1, S2 oder S3) auf beiden Seiten der Aufzeichnungselektrode positioniert, um zwei oder mehr unabhängige, aber überlappende Eingänge zu stimulieren. Positionieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden in einem Abstand von ca. 200 μm.
- Platzieren Sie bei Bedarf eine weitere Aufzeichnungselektrode in der Schichtpyramidenschicht, um den Populationsanstieg aufzuzeichnen (Abbildung 2A). Wenn beide Elektroden die Scheibe berührt haben, führen Sie mit der Erfassungssoftware eine Teststimulation durch, um ein ordnungsgemäßes fEPSP-Signal sicherzustellen.
Anmerkung: Wir verwenden biphasische Konstantstromimpulse (Impulsdauer 0,1 ms/Halbwelle) für die Teststimulation.
- Sobald ein ordnungsgemäßes fEPSP-Signal erhalten wurde, senken Sie die Elektroden vorsichtig mit den feinen Drehknöpfen der Manipulatoren etwa 200 μm tief ab. Warten Sie 20 Minuten, bis sich die Scheiben erholt haben.
- Input-Output-Verhältnis
- Bestimmen Sie das Input-Output-Verhältnis (afferente Stimulation vs. fEPSP-Steigung) für jeden Input, indem Sie den Slope-Wert bei einem Bereich von Stromstärken messen. Führen Sie dies zwischen 20 μA und 100 μA durch. Stellen Sie dann die Stimulationsintensität für jeden Eingang ein, um 40 % der maximalen fEPSP-Steigung zu erhalten. Halten Sie dies während des gesamten Experiments konstant.
- Beginnen Sie nach 15-20 Minuten mit der Aufzeichnung der Grundlinie. Überwachen Sie die fEPSP-Steigung während dieses Zeitraums genau und setzen Sie die Stimulusintensität zurück, wenn die Steigung um mehr als 10 % vom eingestellten Wert abweicht, und beginnen Sie eine neue Ausgangslinie. Notieren Sie mindestens 30 Minuten oder 1 Stunde stabile Ausgangswerte, bevor Sie fortfahren.
Anmerkung: Für den Test oder die Baseline-Stimulation verwenden wir vier Sweeps mit 0,2 Hz biphasischen Konstantstromimpulsen (0,1 ms pro Polarität), die alle 5 min verabreicht werden. Eine durchschnittliche Steigung dieser vier Antworten wird dann als eine Wiederholung betrachtet. Die Signale werden durch einen Differenzverstärker gefiltert und verstärkt, mit einem Analog-Digital-Wandler digitalisiert und online mit einer eigens entwickelten Software überwacht.
