Detektion physiologischer Reaktionen von sensorischen Neuronen in Drosophila

>1. Probenvorbereitung

1. Überqueren Sie die Gal4-Treiberlinie zu UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster fliegt (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Lassen Sie die Kreuzung bei 25 °C wachsen.
   Anmerkung: Die Erzeugung von Fliegen mit mehreren Kopien der Gal4- oder UAS-GCaMP-Transgene kann dazu beitragen, die Intensität des Fluoreszenzsignals zu erhöhen. Eine frühere Version des UAS-GCaMP-Transgens (UAS-GCaMP3) zeigte eine sehr schwache Fluoreszenzintensität, wenn sie unter der Kontrolle des Gr68a-Gal4-Treibers exprimiert wurde.
   1. Frisch eingeschlossene adulte Fliegen sammeln, nach Geschlecht trennen und bei 25 °C aufziehen.
      HINWEIS: Der Ausgangswert der GCaMP5G-Fluoreszenz ist bei Fliegen im Alter zwischen 14 und 28 Tagen optimal. Die Isolierung von Fliegen nach Geschlecht schließt die Möglichkeit sozialer Interaktionen aus, die die neuronalen Reaktionen beeinflussen könnten.
2. Betäuben Sie eine Fliege unter einem milden CO₂ -Strahl.
3. Befestigen Sie den Hosenschlitz an einem Glasdeckglas, indem Sie zuerst einen kleinen Tropfen Nagellack in die Mitte eines 0,17 mm breiten Deckglases geben. Legen Sie eine Fliege vorsichtig auf die Seite auf den Tropfen Klarlack und stellen Sie sicher, dass die Fliege den gesamten Tropfen bedeckt.
4. Führen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 unter einem Präparierstereomikroskop durch, das bei 8-facher Vergrößerung verwendet wird.
5. Verwende einen nassen Pinsel, um das Vorderbein der Fliege zu verlängern. Sichern Sie das Vorderbein in Position, indem Sie zwei dünne Streifen Klebeband über das erste und fünfte Fußwurzelsegment legen (Abbildung 1A). Dadurch werden die Tarsalsegmente T2-T4 für die Bildgebung freigelegt (Abbildung 1B).
6. Um Neuronen auf dem Rüssel abzubilden, legen Sie einen dünnen Streifen Klebeband über das Rostrum des Rüssels, um das Labellum freizulegen (Abbildung 1C, D).
7. Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift (Peroxidase-Antiperoxidase) eine hydrophobe Barriere um die Fliege, um zu verhindern, dass die Lösung über die Deckglasoberfläche fließt. Messen Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Montage.

>2. Zubereitung der Stimuluslösung

1. Verdünnte lipophile Liganden (wie CH₅0₃, verwendet in dieser Studie) in einer PBST-Lösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Triton X-100): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1 % Triton X-100 (v/v); pH 7,4.
   1. Stellen Sie eine 1 mg/ml Stammlösung des Liganden mit PBST her. Bereiten Sie alle nachfolgenden Verdünnungen der Stammlösung mit PBST.
      Anmerkung: Abhängig von der Löslichkeit des interessierenden Liganden können unterschiedliche Lösungsmittel benötigt werden, um ihn aufzulösen. Tabelle 1 beschreibt die Löslichkeit von CH₅0₃ in verschiedenen Lösungsmitteln. Im Gegensatz zu anderen Lösungsmitteln erhöhte PBST die Fluoreszenz nicht.

>3. Stimulation gustatorischer Neuronen und Bildaufnahme

Mit
1. einer 10-μl-Pipettore 10 μl PBST auf die Fußwurzelsegmente auffüllen.
   Anmerkung: Dieser Schritt befeuchtet das Bein und verhindert ein Abdriften der Fußwurzelsegmente.
2. Verwenden Sie ein optisches System, das über eine Kamera verfügt, die über eine ausreichende Geschwindigkeit und Empfindlichkeit verfügt, um ein gutes Fluoreszenzsignal bei hoher Zeitauflösung zu erzielen.
   Anmerkung: Für diese Studie verwendeten wir ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop und eine sCMOS-Kamera (siehe Materialliste).
3. Wählen Sie das spezifische Tarsalsegment und die Neuronen aus, die abgebildet werden sollen. Erwerben Sie drei konfokale Z-Stacks für die Vorstimulation.
   1. Verwenden Sie im Idealfall Erfassungseinstellungen, die schnell genug sind, um eine maximale Zeitauflösung zu ermöglichen und gleichzeitig das gesamte Zellvolumen zu erfassen. Beispiele für Aufnahmeeinstellungen sind: 200 ms Belichtung, Binning von 2 x 2 und 6 x 0,5 μm2 optischen Schnitten, alle 2 Sekunden aufgenommen
      HINWEIS: Immobilisierte Beine wurden erfolgreich bis zu 10 Minuten lang in Intervallen von 30 Sekunden abgebildet, ohne dass ein Bleichen des GCaMP-Signals erkennbar war. Achten Sie bei längeren Aufnahmezeiten darauf, dass die Beine sehr fest auf dem Deckglas gehalten werden.
   2. Optimieren Sie die Laserleistung für das höchste Signal-Rausch-Verhältnis, das bei minimalem Photobleaching während des gesamten Bildgebungszyklus erreicht werden kann. Für die hier beschriebenen Experimente verwenden Sie einen 491-nm-Diodenlaser (100 mW) bei 30 % Transmission, um sowohl Gr68a- als auch ppk23-Geschmacksneuronen an den Beinen und am Rüssel abzubilden. Verwenden Sie 2 x 2 Binning, um kürzere Belichtungszeiten zu ermöglichen und dennoch eine ausreichende räumliche Auflösung zu erzielen.
      Anmerkung: Die Einstellungen für die Laserleistung wurden optimiert, um Fluoreszenzänderungen von 1,2- bis 4,5-facher Erhöhung zu erkennen.
4. Pipettieren Sie 10 μl der Stimuluslösung auf die Fußwurzelsegmente. Fügen Sie weitere 10 μl PBST für Kontrollexperimente hinzu. Erfassen Sie sofort 117 Bilder nach der Stimulation.
   Anmerkung: Die Anzahl der aufgenommenen Bilder nach der Stimulation basiert auf der Zeit, die benötigt wurde, um die maximale Fluoreszenzänderung (ca. 2 Minuten) zu erreichen.
   1. KRITISCHER SCHRITT: Berühren Sie beim Pipettieren der Lösung auf dem Präparat nicht die Fliege mit der Pipettenspitze, da dies dazu führt, dass sich das Vorderbein aus der Position bewegt.
      Anmerkung: Alternativ können Sie einen Mikromanipulator verwenden, um eine Glaskapillare mit Stimulus in der Nähe des abzubildenden Tarsalsegments genau zu positionieren. Geben Sie kontrollierte Stimulusmengen mit einem intrazellulären Mikroinjektionsspender gemäß den Anweisungen des Herstellers ab.

Abbildung 1: Montage einer lebenden Fliege zur Abbildung der Neuronen des Vorderbeins oder des Rüssels. (A) Montage des Vorderbeins: ein 3,2-faches Bild einer lebenden männlichen Fliege, das zeigt, wie die Vorderbeine mit Klebeband am Deckglas befestigt sind. (B) Ein 40-faches Bild der Fliege zeigt jedes der Tarsalsegmente (T1-5) und die Platzierung des Klebebandes über dem ersten Tarsalsegment und auf dem fünften Tarsalsegment. (C) Montage des Rüssels: Ein Stück Klebeband wird über das Rostrum gelegt, um die Spitze des Rüssels freizulegen. (D) Die Pipettenspitze für die Stimuluszugabe wird leicht über die Fliege gehalten und kommt nicht direkt mit dem Präparat in Kontakt.

Tabelle 1: Löslichkeit von CH503 in verschiedenen Lösungsmitteln. DMSO: Dimethylsulfoxid. Ethanol-, Hexan- und DMSO-Lösungen wurden mit dH2O (v/v) verdünnt. Die Löslichkeit von CH503 in 0,2 % DMSO war nur auf 250 ng/ml begrenzt. Der Anstieg von ΔF/F mit Lösungsmittel allein entsprach dem bei Stimulation mit Pheromon beobachteten Anstieg.