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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Chirurgie
HINWEIS: Die genauen Details der Operation für die Closed-Loop-Stimulation hängen von der Art der verwendeten Aufzeichnungssonden und den anvisierten Gehirnbereichen ab. In den meisten Fällen besteht eine typische Operation jedoch aus den folgenden Schritten.
- Bringen Sie einen Käfig mit einer Ratte in den Operationssaal, um eine Silikonsonde oder ein Elektrodenarray zu implantieren, um die neuronale Aktivität aufzuzeichnen.
- Betäuben Sie den Nager mit 2-2,5% Isofluran und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Operation bewusstlos ist, indem Sie jede motorische Reaktion auf leichte taktile Reize beobachten.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Trockenheit während der Operation zu minimieren.
- Rasieren Sie den Operationsbereich und desinfizieren Sie die Haut mit 2%iger Chlorhexidinlösung und 70%igem Isopropylalkohol.
- Injizieren Sie Lidocain (5 mg/kg) unter die Kopfhaut über den Gehirnbereich, in den die Elektroden implantiert werden.
- Machen Sie einen Schnitt der Kopfhaut über dem Bereich des zukünftigen Implantats und verwenden Sie ein Skalpell und ein Wattestäbchen, um das Periost vom freiliegenden Schädel zu befreien.
- Bohren Sie 4-8 Löcher in den Schädel für die Implantation von Ankerschrauben (~0,5 mm) als strukturelle Stütze für das Implantat. Befestigen Sie die Schrauben am Schädel, indem Sie sie in die Löcher stecken und stellen Sie sicher, dass sie fest an Ort und Stelle sitzen.
- Bohren Sie den Kraniotomie an den angegebenen Koordinaten und setzen Sie das Mikrolaufwerk/das Sondenimplantat ein.
Anmerkung: Das beschriebene Protokoll für die Closed-Loop-Stimulation funktioniert für jede Gehirnregion, in die die Elektroden eingeführt werden.
- Befestigen Sie das Mikrolaufwerk/die Sonde und alle erforderlichen elektrischen Schnittstellenstecker mit Zahnacryl am Schädel. Die Menge an Zahnkunststoff sollte ausreichen, um das Implantat fest zu befestigen, aber es sollte nicht mit dem umgebenden Weichgewebe in Berührung kommen.
- Überwachen Sie das Tier nach der Operation engmaschig, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrecht zu erhalten. In den folgenden drei Tagen ist ein Analgetikum (z. B. Metacam, 1 mg/kg) und ein Antibiotikum zur Vorbeugung einer Infektion (z. B. Enrofloxacin, 10 mg/kg) subkutan zu verabreichen.
Anmerkung: Die Tiere müssen sich in der Regel eine Woche lang von der Operation erholen, bevor sie getestet oder aufgezeichnet werden.
>2. Software-Installation
HINWEIS: Dies wurde unter Windows 10, 64-Bit-Version, getestet.
- Installieren Sie eine Datenerfassungs- und -verarbeitungssoftware.
- Installieren Sie das Datenerfassungssystem Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), das Bibliotheken für die Interaktion mit dem Cheetah Acquisition System enthält.
- Installieren Sie SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) oder eine andere Software, die KlustaKwik27 für die Spike-Sortierung verwendet. Die Online-Erkennungssoftware verwendet die Cluster-Definitionen aus der KlustaKwik-Engine. Diese Software kann auf demselben Computer oder auf verschiedenen Computern im selben Netzwerk ausgeführt werden.
- Installieren Sie das NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), das auch von https://neuralynx.com/software/netcom-development-package heruntergeladen werden kann.
- Installieren Sie Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; der Code wurde auf der Matlab-Version R2018a getestet). Stellen Sie sicher, dass Matlab in der Windows-Firewall aktiviert ist. Normalerweise erscheint bei der ersten Verbindung ein Pop-up-Fenster.
- Melden Sie sich bei einem Matlab-Konto an. Wählen Sie die Lizenz aus. Wählen Sie die Version aus. Wählen Sie das Betriebssystem aus.
- Laden Sie die folgende Bibliothek für das Auslösen von Online-Ereignissen von https://github.com/leomol/cheetah-interface herunter und extrahieren Sie die Dateien in den Ordner "Documents/Matlab" des Computers. Eine Kopie des Codes finden Sie in den begleitenden Zusatzmaterialien.
>3. Anfängliche Datenerfassung
- Starten Sie die Datenerfassung mit der Cheetah-Software.
- Zeichnen Sie einige Minuten Spike-Daten auf, um Vorlagen-Wellenformen zu füllen.
- Stoppen Sie die Datenerfassung und führen Sie eine Spike-Sortierung für die aufgezeichneten Daten durch.
- Öffnen Sie SpikeSort3D, klicken Sie auf Datei | Speisekarte | Laden Sie die Spike-Datei und wählen Sie eine Spike-Datei aus dem Ordner mit den aufgezeichneten Daten aus.
- Klicken Sie auf Cluster-Menü, dann auf Autocluster mit KlustaKwik, behalten Sie die Standardeinstellungen bei, und klicken Sie auf Ausführen.
>4. Geschlossenes Experiment
- Setzen Sie die Datenerfassung in Cheetah fort.
- Öffnen Sie Matlab.
- Öffnen Sie ClosedLoop.m und klicken Sie auf Ausführen. Alternativ können Sie im Matlab-Befehlsfenster ClosedLoop() ausführen. Stellen Sie sicher, dass sich ClosedLoop.m im Matlab-Pfad befindet. Wenn der Benutzer eine benutzerdefinierte Funktion verwenden möchte, um jeden Trigger aufzurufen, führen Sie stattdessen ClosedLoop('-callback', customFunction) aus, wobei customFunction ein Handle für diese Funktion ist.
- Laden Sie die Spike-Informationen, die in der ersten Aufzeichnung definiert sind, indem Sie auf Laden klicken, den Aufzeichnungsordner durchsuchen und eine der Spike-Datendateien (.ntt, .nse) auswählen.
- Wählen Sie ein oder mehrere Neuronen aus, die die Stimulation auslösen sollen, indem Sie auf das Kontrollkästchen unter den dargestellten Wellenformen klicken.
- Definieren Sie die minimale Anzahl von Neuronen, die die Stimulation auslösen, indem Sie eine Ganzzahl in das Textfeld "min matches" eingeben. Definieren Sie dann das Zeitfenster, in dem Spikes, die mit unterschiedlichen Wellenformen übereinstimmen, als koaktiv betrachtet werden, indem Sie eine Zahl in das Textfeld "Fenster" eingeben.
- Klicken Sie auf Senden, um zu starten. Dadurch wird das Online-Auslösen von Ereignissen (standardmäßig Töne) basierend auf der Spike-Aktivität ausgewählter Neuronen gestartet.