Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Kinnavane, L., et al. Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entorhinalen Kortex. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Elektrophysiologie und optogenetische Stimulation

1. Identifizierung der Zielzelle.
   1. Legen Sie die Scheibe in eine untergetauchte Aufnahmekammer bei 34 °C, die mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min durch eine Peristaltikpumpe perfundiert wird. Immobilisieren Sie das Slice mit einem Slice-Anker.
   2. Navigieren Sie unter dem Objektiv mit geringer Vergrößerung (4x) eines Weitfeldmikroskops mit schräger Infrarotbeleuchtung zur Schicht 5 des lateralen entorhinalen Kortex (LEC). Messen Sie den Abstand von der Pial-Oberfläche zur gewünschten Schicht.
      Anmerkung: Eine schräge Infrarotbeleuchtung wurde erreicht, indem eine Nahinfrarot-LED etwa 3 mm unterhalb des Deckglases der Aufnahmekammer in einem Winkel von ~55° zur Ebene des Deckglases positioniert wurde (Abbildung 1B). Der differentielle Interferenzkontrast ist ein alternatives und häufig verwendetes bildgebendes Verfahren für die Schichtelektrophysiologie.
   3. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung (40x) und identifizieren Sie pyramidale Neuronen. Markieren Sie die Position der Zelle auf dem Computermonitor mit Klebeband.
      Anmerkung: Die pyramidalen Neurone haben eine annähernd dreieckige Morphologie mit markanten apikalen Dendriten, die zur pialen Oberfläche des Schnitts projizieren (Abbildung 2A). Die Zellgesundheit kann durch das Fehlen eines kondensierten, sichtbaren Zellkerns und die Inspektion der Plasmamembran beurteilt werden, die glatt erscheinen sollte. Es ist unwahrscheinlich, dass eine klare Fluoreszenzmarkierung von Axonen durch das Opsin-Fluorophor-Fusionsprotein sichtbar ist, wenn ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verwendet wird. Um axonale Projektionen sichtbar zu machen, führen Sie post-hoc eine Immunhistochemie mit einem primären Antikörper gegen das Fluorophor des Opsins durch und amplifizieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor der gleichen oder einer ähnlichen Wellenlänge konjugiert ist.
2. Bildung einer Ganzzell-Patch-Klemme.​
   1. Stellen Sie mit einem Pipettenabzieher eine Mikropipette aus Borosilikatglas her und füllen Sie sie mit gefilterter intrazellulärer Aufzeichnungslösung (120 mM k-Gluconat, 40 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 10 mM KCl (Kaliumchlorid), 2 mM NaCl (Natriumchlorid), 2 mM MgATP (Magnesiumadenosintriphosphat), 1 mM MgCl (Magnesiumchlorid), 0,3 mM NaGTP (Natriumguanosintriphosphat), 0,2 mM EGTA (Ethylenglykoltetraessigsäure), und 0,25 % Biocytin, hergestellt in UPW (Reinstwasser), pH 7,25, 285-300 mOsm). Legen Sie die gefüllte Mikropipette in den Elektrodenhalter auf dem Kopftisch des Patch-Clamp-Verstärkers und stellen Sie sicher, dass der Elektrodendraht in Kontakt mit der intrazellulären Lösung ist.
   2. Üben Sie mit dem Mund Überdruck aus, indem Sie kräftig in ein Mundstück blasen (z. B. eine 1-ml-Spritze mit entferntem Kolben), das über einen Schlauch mit dem seitlichen Anschluss des Elektrodenhalters verbunden ist, und halten Sie den Druck aufrecht, indem Sie ein Inline-Dreiwegeventil schließen. Heben Sie das Mikroskopobjektiv so an, dass sich ein Meniskus bildet, und führen Sie die Elektrode in den Meniskus ein, bis sie auf dem Mikroskop zu sehen ist.
   3. Öffnen Sie das Fenster Dichtheitstest in WinLTP16 (oder einer anderen Erfassungssoftware/einem anderen Oszilloskop) und legen Sie bei Verstärker im Voltage-Clamp-Modus einen 5-mV-Rechteckimpuls an, um zu bestimmen, ob der Pipettenwiderstand 3-6 MΩ beträgt.
   4. Nähern Sie sich der identifizierten Zelle und berühren Sie sie mit der Pipettenspitze; dies sollte zu einer Vertiefung in der Zellmembran (Abbildung 2A; rechtes Bild) und einer geringfügigen Erhöhung des Pipettenwiderstands (0,1 MΩ) führen.
   5. Lassen Sie den Überdruck ab und üben Sie einen Unterdruck aus, indem Sie einen moderaten Sog am Mundstück ausüben, was zu einer enormen Erhöhung des Pipettenwiderstands (>1000 MΩ) führen sollte. Der Druck kann nun neutral gelassen werden. Üben Sie Unterdruck in einer allmählich ansteigenden Rampe aus, bis die Zellmembran reißt, was zu Kapazitätstransienten der gesamten Zelle führt.
3. Zeichnen Sie optogenetisch evozierte synaptische Ereignisse auf.
   1. Geben Sie die Stromzange configuration ein.
      HINWEIS: In den meisten Fällen ist die synaptische Übertragung über große Entfernungen glutamaterg, daher wird die Aufzeichnung bei Membranpotentialen in der Nähe des Chloridumkehrpotentials die AMPA-Rezeptor (AMPAR)-vermittelte Übertragung am besten isolieren und die Messung einer evozierten Feed-Forward-Hemmung (FFI) minimieren. Die Chloridumkehr hängt von der Zusammensetzung der intrazellulären Aufzeichnungslösung und des aCSF ab und kann mit der Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung berechnet werden. für die oben genannten Lösungen betrug dieser -61,3 mV. Die LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 hatten ein durchschnittliches Ruhemembranpotential von -62 mV und wurden, falls erforderlich, durch Injektion von konstantem Strom auf diesem Potential gehalten. Alternativ können Zellen auf das gewünschte Potential spannungsgeklemmt werden. Zur Aufzeichnung von hemmlichen Projektionen über große Entfernungen16 oder zur Aufzeichnung von FFI wird die Spannung am Kationenumkehrpotential gemessen, um die GABAerge Chloridleitfähigkeit zu isolieren. Bei der Spannungsklemmung von Neuronen an Membranpotentialen oberhalb der Aktionspotentialschwelle wird eine intrazelluläre Lösung auf Cäsiumbasis verwendet, die spannungsgesteuerte Natriumkanalblocker enthält, um die Spannungsklemmung zu verbessern und die Initiierung von Aktionspotentialen zu verhindern (130 mM CsMeSO4 (Cäsiummethansulfonat), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 Chlorid, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25 % Biocytin hergestellt in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Senden Sie mithilfe einer Datenerfassungssoftware TTL-Signale (Transistor-Transistor-Logik) an einen LED-Treiber (Light Emitting Diode), um eine montierte 470-nm-LED zu aktivieren. Die montierte LED wird mit Hilfe von Filterwürfeln und entsprechender Optik (Abbildung 1B) in den Strahlengang des Mikroskops gerichtet, um über das 40x-Objektiv Lichtimpulse auf die Scheibe aufzuweisen, um optogenetische exzitatorische postsynaptische Potentiale (oEPSPs) hervorzurufen.
      Anmerkung: Lichtimpulse können perisomatisch/über den Dendriten angelegt werden, was zur Aktivierung von Opsinen in den Axonen und präsynaptischem Bouton führt, oder der Untersucher kann das Objektiv zu den Axonen weg von der aufgezeichneten Zelle bewegen, um eine Über-Bouton-Stimulation zu vermeiden. Die maximale oEPSP-Amplitude hängt von der Stärke der synaptischen Projektion, der Wirksamkeit der Virusinjektionen und dem verwendeten Opsin ab. oEPSPs können durch Variation der Lichtintensität und/oder -dauer auf die gewünschte Amplitude titriert werden18; Die Variation der Dauer der Lichtimpulse (typische Dauer zwischen 0,2 und 5 ms bei maximaler LED-Ausgangsleistung, was zu einer Lichtdichte von 4,4 mW/mm führt19) führt zu gleichmäßigeren oEPSP-Amplituden als die Änderung der Ausgangsleistung der LED.
   3. Untersuchung der präsynaptischen Freisetzungseigenschaften (Spannungsänderung) durch Abgabe von Zügen mehrerer Lichtpulse mit unterschiedlichen Inter-Stimulus-Intervallen (Abbildung 2E); bei der Interpretation optogenetisch evozierter Transmission ist Vorsicht geboten.
   4. Untersuchung der Langzeitplastizität entweder durch wiederholtes Aufrufen von oEPSPs19 oder durch Applikation von Liganden. Überwachen Sie die oEPSP-Amplitude 5-10 Minuten lang, um die Stabilität vor der Induktion der Plastizität zu gewährleisten, und überwachen Sie dann, bis eine stabile Amplitude erreicht ist (typischerweise 30-40 Minuten).
      Anmerkung: Die meisten aktuellen Opsine sind nicht in der Lage, mehrere Aktionspotentiale bei hohen Frequenzen zuverlässig hervorzurufen, z. B. 100 Stimuli bei 100 Hz, wie es typischerweise zur Induktion von LTP verwendet wird.
   5. Um zu bestätigen, dass oEPSPs monosynaptisch sind, führen Sie eine Over-Bouton-Aktivierung des transduzierten Signalwegs durch, indem Sie das Objektiv über dem dendritischen Dorn positionieren und in Gegenwart von 0,5 μM Tetrodotoxin und 100 μM Aminopyridin stimulieren. Die Anwendung von Tetrodotoxin hebt die Übertragung auf, wenn die Reaktionen vom Aktionspotenzial abhängen, und die anschließende Einfügung von Aminopyridin stellt die Übertragung teilweise wieder her, wenn die oEPSPs monosynaptisch erzeugt werden19,20.
   6. Damit Biocytin das Neuron füllen kann, warten Sie mindestens 15 Minuten, nachdem Sie in die Ganzzellkonfiguration eingetreten sind. In der Spannungsklemme ist die Membrankapazität und der Eingangswiderstand zu überwachen.
   7. Ziehen Sie die Pipette langsam entlang des Annäherungswinkels weg vom Soma der Zelle zurück und beobachten Sie das langsame Verschwinden von Kapazitätstransienten und Membranströmen, was auf die Wiederversiegelung der Zellmembran und die Bildung eines nach außen gerichteten Pflasters an der Pipettenspitze hinweist. Notieren Sie sich die Ausrichtung des Segments und die Position der Zelle(n) innerhalb des Segments. Legen Sie die Scheibe in eine 24-Well-Platte in PFA (Paraformaldehyd), inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C und überführen Sie sie dann auf 0,1 M PB.
      Anmerkung: Die Scheiben können bis zu einer Woche gelagert werden. Wenn eine längere Lagerung erforderlich ist, wechseln Sie den PB (Phosphatpuffer) regelmäßig oder verwenden Sie PB, das Natriumazid (0,02%-0,2% Natriumazid) enthält.

Ergebnisse

Abbildung 1: Slice-Sammelkammer und optische Konfiguration für visualisierte Ganzzellaufzeichnungen, optogenetische Erregung und Identifizierung von tdTomato-positiven Neuronen. (A) Die Scheibensammelkammer 14 ist eine Sonderanfertigung aus einem Mikrozentrifugenröhrchengestell, das auf eine Folie aus Nylonnetz geklebt und in ein Becherglas gelegt wird, in das es in aCSF (...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Wege-Luer-Ventil	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: WZ-30600-02
40x Objektiv	Olymp	LUMPLFLN40XW
4-Aminopyridin	Hallo Biografie	Nr. HB1073
4x Objektiv	Olymp	4X/0,1 PLN/0,1
achromatische Linse	Edmund Optik	Artikel-Nr.: 49363	Fokussiert das visuelle Spektrum und das nahe IR
Tisch-Mikrozentrifuge	Benchmark Wissenschaftlich	Nr. C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	Nr. B4261
Kapillare aus Borosilliatglas	Warner Instruments	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	Nr. C5670
Kamera - Qimaging Retiga Electro	Photometrie	01-ELEKTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	Nr. 2810
Chirurgisches Peeling mit Chlorhexidin	Vetasept	XHG008
Haarschneidemaschine	Andis	Artikel-Nr.: 22445	AGC Super 2-fach Abnehmbare Klingenschermaschine
Kollimationskondensor-Linse	ThorLabs (Englisch)	ACL2520-A
Deckgläser	Fisher Scientific GmbH	10011913
Kälteregler	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	Nr. C1426
Cyanacrylat-Kleber	Rapid Electronics GmbH	Tel.: 84-4557
Datenerfassungsgerät	Nationale Instrumente	USB-6341 BNC
D-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G8270
Dichroitischer Spiegel 500 nm Langpass	Edmund Optik	Artikel-Nr.: 69899
Dichroitischer Spiegel 600 nm Langpass	Edmund Optik	Artikel-Nr.: 69901
Dichroitischer Spiegelwürfel	ThorLabs (Englisch)	CM1-DCH/M
EGTA (EGTA)	Millpore	324626
Elektrodenhalter mit seitlichem Anschluss	HEKA	Artikel-Nr.: 895150
Emissionsfilter	chroma	59022m
Anregungsfilter	chroma	ET570/20x
Augengel	Dechra	Lubrithal
Feiner Pinsel	Wissenschaftlicher Laborbedarf	BRU2052
Guillotine	Welt Präzisionsinstrumente	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H3375
Wasserstoffperoxid-Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. H1009	30% (w/w)
Isofluran	Henry Schein	Tel.: 988-3245
Isopentan	Sigma-Aldrich	Nr. M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	Nr. P3911
K-Gluconat	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematischer Fluoreszenzfilterwürfel	ThorLabs (Englisch)	DFM1T1
LED-Treiber	ThorLabs (Englisch)	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	Nr. A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Abzieher für Mikroelektroden	Sutter-Instrumente	P-87
Mikroinjektionsspritze	Hamilton	Nr. 7634-01/00
Nadel für Mikroinjektionsspritze	Hamilton	Artikel-Nr.: 7803-05	Kundenspezifische Spezifikation: Spur 33, Länge 15 mm, Punktform 4 - 12°
Pumpe für Mikroinjektionsspritzen	Welt Präzisionsinstrumente	UMP3T-1
Montierte blaue LED	ThorLabs (Englisch)	M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Nr. S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	Nr. G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Nr. S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	Nr. S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	Nr. S5761
NIR-LED	OSRAM	SFH4550	Differential-Interferenzkontrast-Optik (DIC) wird für die gebrochene IR-Bildgebung von Schichten verwendet und ist eine weitere häufig verwendete Methode
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Nr. P6148
Patch-Clamp-Verstärker	Molekulare Bauelemente	700A
Peristaltische Pumpe	Welt Präzisionsinstrumente	Ministar
Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger	Fisher Scientific GmbH	Tel.: 23-769-310
Aufnahmekammer	Warner Instruments	RC-26G
Slice-Anker	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Stereotaktischer Halter für Mikrobohrer	Harvard-Apparatur	75-1874
Saccharose	Sigma-Aldrich	Nr. S0389
Operationsmikroskop	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Spritzenvorsatzfilter für intrazelluläre Aufzeichnungslösung	Thermo Scientific Nalgene	Tel.: 171-0020
Aufstehendes Fluoreszenzmikroskop	Leica	DM6 B
Lösung
aCSF
Saccharose-Schneidlösung
PFA