Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

Zusammenfassung

Quelle: Kopke, D. L., et al., FM Farbstoffzyklus an der Synapse: Vergleich von hoher Kaliumdepolarisation, elektrischer und Kanalrhodopsin-Stimulation. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Protokoll

1. Sektion von Larvenkleber

1. Mischen Sie 10 Teile Silikonelastomerbasis gründlich mit 1 Teil Silikonelastomer-Härter aus dem Elastomer-Kit.
2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit dem Elastomer beschichten und auf einer Heizplatte bei 75 °C mehrere Stunden aushärten (bis sie nicht mehr kleben
).
3. Legen Sie ein einzelnes elastomerbeschichtetes Glasdeckglas in die speziell angefertigte Plexiglas-Dissektionskammer für die Larvendissektion.
4. Bereiten Sie die Leimpipetten aus Borosilikatglaskapillare mit einem Standard-Mikroelektrodenabzieher vor, um die gewünschte Verjüngung und Spitzengröße zu erhalten.
5. Brechen Sie die Mikropipettenspitze vorsichtig ab und befestigen Sie am anderen Ende einen 2 Fuß langen flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, Innendurchmesser; 3/32" Außendurchmesser, Außendurchmesser; 1/32" Wand; mit Mundanschluss (P2 Pipettenspitze).
6. Füllen Sie zur Vorbereitung der Larvendissektion ein kleines Gefäß (0,6 mL Eppendorf Tube Cap) mit einem kleinen Volumen (~20 μL) Kleber.
7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,2.
8. Fügen Sie einen Anti-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Antikörper hinzu, der an Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; 1:10 aus einem 1 mg/ml-Stamm verdünnt) konjugiert ist, um das präsynaptische NMJ-Terminal während der Dissektion zu markieren21,22.
9. Entfernen Sie mit einem feinen Pinsel (Größe 2) ein wanderndes drittes Instar aus dem Lebensmittelfläschchen und legen Sie es auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
10. Füllen Sie die Spitze der Mikropipette aus Glas mit einer kleinen Menge Klebstoff unter Verwendung eines negativen Luftdrucks, der durch den Mund mit Aufsatz erzeugt wird (Schritt 1.5).
11. Positionieren Sie die Rückenseite der Larve mit einer Pinzette nach oben und kleben Sie den Kopf mit einem kleinen Tropfen Kleber unter Verwendung von positivem Luftdruck mit dem Mund auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende der Larve und stellen Sie sicher, dass das Tier zwischen den beiden Kleberansätzen straff gespannt ist.
13. Machen Sie mit einer Schere (Klingen 3 mm) einen horizontalen Schnitt (~1 mm) am hinteren und einen vertikalen Schnitt entlang der gesamten dorsalen Mittellinie.
14. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette (#5) vorsichtig die dorsale Luftröhre, den Darm, den Fettkörper und andere innere Organe, die die Muskulatur bedecken.
15. Wiederholen Sie den Klebevorgang für die vier Korpuswandklappen und dehnen Sie die Korpuswand vorsichtig horizontal und vertikal.
16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit einer Pinzette an, durchtrennen Sie vorsichtig die motorischen Nerven mit der Schere und entfernen Sie dann den VNC vollständig.
17. Um den SV-Zyklus zu stoppen, ersetzen Sie die Dissektionskochsalzlösung durch Ca²⁺-freie Kochsalzlösung (die gleiche wie die obige Dissektionskochsalzlösung ohne CaCl₂).

2. Elektrische Stimulation FM Farbstoffbeladung

1. Bereiten Sie mit dem Mikroelektrodenabzieher eine Saugpipette vor, um den erforderlichen Kegel und die gewünschte Spitzengröße zu erhalten.
Die
2. Mikroelektrodenspitze mit einer Mikroschmiede so lange feuerpolieren, bis ein einzelner motorischer Nerv fest angesaugt werden kann.
3. Schieben Sie die Saugpipette auf den Elektrodenhalter eines Mikromanipulators und befestigen Sie sie an dem langen flexiblen Kunststoffschlauch und einer Spritze.
4. Stellen Sie die Stimulatorparameter ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min oder 1 min.
5. Ersetzen Sie die Ca2⁺-freie Kochsalzlösung in der Larvenpräparation durch die obige FM1-43-Kochsalzlösung (4 μM; 1 mM CaCl₂) in der Elektrophysiologie-Rig.
6. Legen Sie das Präparat auf den Mikroskoptisch und heben Sie den Tisch an, bis die Larve und die Saugpipette fokussiert sind (40-faches Wasserimmersionsobjektiv).
7. Eine Schleife des durchtrennten motorischen Nervs, die das ausgewählte Hemisegment innerviert, wird mit negativem Luftdruck, der von der Spritze erzeugt wird, in die Saugelektrode gesaugt.
8. Testen Sie die Funktion der Saugelektrode mit einem kurzen Stimulationsstoß, während Sie die Muskelkontraktion im ausgewählten Hemisegment visuell überwachen.
9. Stimulieren Sie den motorischen Nerv mit ausgewählten Parametern (Schritt 2.4), um die SV-Endozytose und die Aufnahme von FM1-43-Farbstoffen zu steuern.
10. Schnell mit Ca²⁺-freier Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um die Färbelösung FM1-43 vollständig zu entfernen.
11. Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2⁺-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem konfokalen Bildgebungsprotokoll von oben auf.
12. Notieren Sie sich das NMJ-Bild (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass nach dem Entladen des FM-Farbstoffs auf dasselbe NMJ zugegriffen
werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Fisher Scientific	NC9644388	Zum Aufsetzen von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Zum Anlegen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Top-Heizplatte Typ 2200	Thermolyne	HPA2235M	Um den SylGard zu heilen
Präparierkammer aus Plexiglas	N/A	N/A	handgemacht
Kapillaren aus Borosilikatglas	WPI	1B100F-4	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierter Mikropipettenabzieher	Sutter-Instrument	P-2000	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 Laborschlauch	Komponentenversorgung Co.	TET-031A	Für Mund- und Saugpipette
P2 Pipettenspitze	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1111-3700	Für Mundpipette
0,6-ml-Eppendorf-Röhrchenkappe	Fisher Scientific	Tel.: 05-408-120	Wird verwendet, um Klebstoff zum Sezieren einzubringen
Vetbond 3M	WPI	Vetbond	Kleber zum Sezieren
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P-217	Forsalin
Natriumchlorid	Millipore Sigma	Nr. S5886	Für Kochsalzlösung
Magnesiumchlorid	Fisher Scientific	M35-500	Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid-Dihydrat	Millipore Sigma	Nr. C7902	Für Kochsalzlösung
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Für Kochsalzlösung
HEPES	Millipore Sigma	Nr. H3375	Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson Immunforschung	Tel.: 123-605-021	Zur Markierung neuronaler Membranen
Pinsel	Winsor & Newton	94376864793	Um die Larven zu manipulieren
Dumont Dumostar Pinzette #5	WPI	500233	Wird beim Präparieren verwendet
7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)	WPI	Artikel-Nr.: 14177	Wird beim Präparieren verwendet
FM1-43	Fisher Scientific	Nr. T35356	Fluoreszierender Styrolylfarbstoff
Digitaler Timer	VWR	Tel.: 62344-641	Für das Timing des FM-Färbe-Ladens/Entladens
Mikro-Schmiede	WPI	MF200	Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
20 ml Spritzen-Aufsteckspitze	Bd	301625	Um das Axon für die elektrische Stimulation aufzusaugen.
Mikromanipulator (magnetischer Sockel)	Narishige	MMN-9	Zur Steuerung der Saugelektrode für die elektrische Stimulation
Anreger	Gras	Nr. S48	Zur Steuerung der LED und der elektrischen Stimulation
Zeiss Axioskop Mikroskop	Zeiss		Wird während der elektrischen Stimulation verwendet.
40X Achroplan Wasserimmersionsobjektiv	Zeiss		Wird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung verwendet
Zeiss Stemi Mikroskop mit Kameraanschluss	Zeiss	2000-C	Wird während der Stimulation von Channelrhodopsin verwendet
T-Cube LED-Treiber	ThorLabs (Englisch)	LEDD1B	So steuern Sie die LED
LED-Netzteil	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	So schalten Sie die LED ein
Optischer Leistungs- und Energiezähler	ThorLabs (Englisch)	PM100D	So messen Sie die LED-Intensität