Methodenartikel

Mikroelektrodenvermitteltes Be- und Entladen von FM-Farbstoffen in Nervenzellen von Drosophila-Larven

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Kopke, D. L., et al., FM Farbstoffzyklus an der Synapse: Vergleich von hoher Kaliumdepolarisation, elektrischer und Kanalrhodopsin-Stimulation. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video werden die Nervenfasern der Drosophila-Larven in FM-Farbstoff getaucht, der an die Lipide der Zellmembran bindet. Saugmikroelektrode und elektrische Impulse stimulieren den Endozytoseprozess, indem der FM-Farbstoff in neu gebildete endozytäre Vesikel eingebaut wird. Diese Methode, die präsynaptische Stadien der Neurotransmission sichtbar macht, ist nützlich, um die synaptische Funktion und die Freisetzung von Neurotransmittern zu untersuchen.

Protokoll

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1. Sektion von Larvenkleber

  1. Mischen Sie 10 Teile Silikonelastomerbasis gründlich mit 1 Teil Silikonelastomer-Härter aus dem Elastomer-Kit.
  2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit dem Elastomer beschichten und auf einer Heizplatte bei 75 °C mehrere Stunden aushärten (bis sie nicht mehr kleben
    3. ).
  3. Legen Sie ein einzelnes elastomerbeschichtetes Glasdeckglas in die speziell angefertigte Plexiglas-Dissektionskammer für die Larvendissektion.
  4. Bereiten Sie die Leimpipetten aus Borosilikatglaskapillare mit einem Standard-Mikroelektrodenabzieher vor, um die gewünschte Verjüngung und Spitzengröße zu erhalten.
  5. Brechen Sie die Mikropipettenspitze vorsichtig ab und befestigen Sie am anderen Ende einen 2 Fuß langen flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, Innendurchmesser; 3/32" Außendurchmesser, Außendurchmesser; 1/32" Wand; mit Mundanschluss (P2 Pipettenspitze).
  6. Füllen Sie zur Vorbereitung der Larvendissektion ein kleines Gefäß (0,6 mL Eppendorf Tube Cap) mit einem kleinen Volumen (~20 μL) Kleber.
  7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,2.
  8. Fügen Sie einen Anti-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Antikörper hinzu, der an Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; 1:10 aus einem 1 mg/ml-Stamm verdünnt) konjugiert ist, um das präsynaptische NMJ-Terminal während der Dissektion zu markieren21,22.
  9. Entfernen Sie mit einem feinen Pinsel (Größe 2) ein wanderndes drittes Instar aus dem Lebensmittelfläschchen und legen Sie es auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
  10. Füllen Sie die Spitze der Mikropipette aus Glas mit einer kleinen Menge Klebstoff unter Verwendung eines negativen Luftdrucks, der durch den Mund mit Aufsatz erzeugt wird (Schritt 1.5).
  11. Positionieren Sie die Rückenseite der Larve mit einer Pinzette nach oben und kleben Sie den Kopf mit einem kleinen Tropfen Kleber unter Verwendung von positivem Luftdruck mit dem Mund auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
  12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende der Larve und stellen Sie sicher, dass das Tier zwischen den beiden Kleberansätzen straff gespannt ist.
  13. Machen Sie mit einer Schere (Klingen 3 mm) einen horizontalen Schnitt (~1 mm) am hinteren und einen vertikalen Schnitt entlang der gesamten dorsalen Mittellinie.
  14. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette (#5) vorsichtig die dorsale Luftröhre, den Darm, den Fettkörper und andere innere Organe, die die Muskulatur bedecken.
  15. Wiederholen Sie den Klebevorgang für die vier Korpuswandklappen und dehnen Sie die Korpuswand vorsichtig horizontal und vertikal.
  16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit einer Pinzette an, durchtrennen Sie vorsichtig die motorischen Nerven mit der Schere und entfernen Sie dann den VNC vollständig.
  17. Um den SV-Zyklus zu stoppen, ersetzen Sie die Dissektionskochsalzlösung durch Ca2+-freie Kochsalzlösung (die gleiche wie die obige Dissektionskochsalzlösung ohne CaCl2).

2. Elektrische Stimulation FM Farbstoffbeladung

  1. Bereiten Sie mit dem Mikroelektrodenabzieher eine Saugpipette vor, um den erforderlichen Kegel und die gewünschte Spitzengröße zu erhalten.
    2. Die
  2. Mikroelektrodenspitze mit einer Mikroschmiede so lange feuerpolieren, bis ein einzelner motorischer Nerv fest angesaugt werden kann.
  3. Schieben Sie die Saugpipette auf den Elektrodenhalter eines Mikromanipulators und befestigen Sie sie an dem langen flexiblen Kunststoffschlauch und einer Spritze.
  4. Stellen Sie die Stimulatorparameter ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min oder 1 min.
  5. Ersetzen Sie die Ca2+-freie Kochsalzlösung in der Larvenpräparation durch die obige FM1-43-Kochsalzlösung (4 μM; 1 mM CaCl2) in der Elektrophysiologie-Rig.
  6. Legen Sie das Präparat auf den Mikroskoptisch und heben Sie den Tisch an, bis die Larve und die Saugpipette fokussiert sind (40-faches Wasserimmersionsobjektiv).
  7. Eine Schleife des durchtrennten motorischen Nervs, die das ausgewählte Hemisegment innerviert, wird mit negativem Luftdruck, der von der Spritze erzeugt wird, in die Saugelektrode gesaugt.
  8. Testen Sie die Funktion der Saugelektrode mit einem kurzen Stimulationsstoß, während Sie die Muskelkontraktion im ausgewählten Hemisegment visuell überwachen.
  9. Stimulieren Sie den motorischen Nerv mit ausgewählten Parametern (Schritt 2.4), um die SV-Endozytose und die Aufnahme von FM1-43-Farbstoffen zu steuern.
  10. Schnell mit Ca2+-freier Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um die Färbelösung FM1-43 vollständig zu entfernen.
  11. Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2+-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem konfokalen Bildgebungsprotokoll von oben auf.
  12. Notieren Sie sich das NMJ-Bild (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass nach dem Entladen des FM-Farbstoffs auf dasselbe NMJ zugegriffen
    13. werden kann.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-KitFisher ScientificNC9644388Zum Aufsetzen von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1Fisherbrand12-542-BZum Anlegen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Top-Heizplatte Typ 2200ThermolyneHPA2235MUm den SylGard zu heilen
Präparierkammer aus PlexiglasN/AN/Ahandgemacht
Kapillaren aus BorosilikatglasWPI1B100F-4Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierter MikropipettenabzieherSutter-InstrumentP-2000Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 LaborschlauchKomponentenversorgung Co.TET-031AFür Mund- und Saugpipette
P2 PipettenspitzeUSA WissenschaftlichTel.: 1111-3700Für Mundpipette
0,6-ml-Eppendorf-RöhrchenkappeFisher ScientificTel.: 05-408-120Wird verwendet, um Klebstoff zum Sezieren einzubringen
Vetbond 3MWPIVetbondKleber zum Sezieren
KaliumchloridFisher ScientificP-217Forsalin
NatriumchloridMillipore SigmaNr. S5886Für Kochsalzlösung
MagnesiumchloridFisher ScientificM35-500Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid-DihydratMillipore SigmaNr. C7902Für Kochsalzlösung
SaccharoseFisher ScientificS5-3Für Kochsalzlösung
HEPESMillipore SigmaNr. H3375Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunforschungTel.: 123-605-021Zur Markierung neuronaler Membranen
PinselWinsor & Newton94376864793Um die Larven zu manipulieren
Dumont Dumostar Pinzette #5WPI500233Wird beim Präparieren verwendet
7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)WPIArtikel-Nr.: 14177Wird beim Präparieren verwendet
FM1-43Fisher ScientificNr. T35356Fluoreszierender Styrolylfarbstoff
Digitaler TimerVWRTel.: 62344-641Für das Timing des FM-Färbe-Ladens/Entladens
Mikro-SchmiedeWPIMF200Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
20 ml Spritzen-AufsteckspitzeBd301625Um das Axon für die elektrische Stimulation aufzusaugen.
Mikromanipulator (magnetischer Sockel)NarishigeMMN-9Zur Steuerung der Saugelektrode für die elektrische Stimulation
AnregerGrasNr. S48Zur Steuerung der LED und der elektrischen Stimulation
Zeiss Axioskop MikroskopZeissWird während der elektrischen Stimulation verwendet.
40X Achroplan WasserimmersionsobjektivZeissWird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung verwendet
Zeiss Stemi Mikroskop mit KameraanschlussZeiss2000-CWird während der Stimulation von Channelrhodopsin verwendet
T-Cube LED-TreiberThorLabs (Englisch)LEDD1BSo steuern Sie die LED
LED-NetzteilCincon Electronics Co.TR15RA150So schalten Sie die LED ein
Optischer Leistungs- und EnergiezählerThorLabs (Englisch)PM100DSo messen Sie die LED-Intensität

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Schlagwörter

FM Dye LoadingFM Dye UnloadingSuction MicroelectrodeElectrical StimulationDrosophila LarvaeNerve FibersSynaptic Vesicle EndocytosisNeuromuscular JunctionMicromanipulator UnitMicroelectrode Puller

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