Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Zusammenfassung

Quelle: Kopke, D. L., et al., FM Farbstoffkreislauf an der Synapse: Vergleich von hoher Kalium-Depolarisation, elektrischer und Channelrhodopsin-Stimulation. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere Stimulation des blauen Lichts induziert eine Exozytose und Farbstofffreisetzung, was sich in einer verminderten Fluoreszenz zeigt.

Protokoll

>1. Sektion von Larvenkleber

1. Mischen Sie 10 Teile Silikonelastomerbasis gründlich mit 1 Teil Silikonelastomer-Härter aus dem Elastomer-Kit (Materialtabelle).
2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit dem Elastomer beschichten und auf einer Heizplatte bei 75 °C mehrere Stunden aushärten (bis sie nicht mehr kleben
).
3. Legen Sie ein einzelnes elastomerbeschichtetes Glasdeckglas in die speziell angefertigte Plexiglas-Dissektionskammer (Abbildung 1, unten), um die Larvendissektion vorzubereiten.
4. Bereiten Sie die Leimpipetten aus Borosilikatglaskapillare mit einem Standard-Mikroelektrodenabzieher vor, um die gewünschte Verjüngung und Spitzengröße zu erhalten.
5. Brechen Sie die Spitze der Mikropipette vorsichtig ab und befestigen Sie am anderen Ende einen flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, ID; 3/32" Außendurchmesser, OD; 1/32" Wand; Tabelle der Materialien) mit Mundanschluss (Pipettenspitze P2).
6. Füllen Sie einen kleinen Behälter (0,6 mL Eppendorf-Röhrchenkappe) mit einem kleinen Volumen (~20 μL) Klebstoff (Materialtabelle) zur Vorbereitung der Larvendissektion
.
7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,2.
8. Fügen Sie einen Anti-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Antikörper hinzu, der an Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; 1:10 verdünnt von einem 1 mg/ml-Stamm) konjugiert ist, um das präsynaptische Terminal der neuromuskulären Verbindung (NMJ) während der Dissektion zu markieren.
9. Entfernen Sie mit einem feinen Pinsel (Größe 2) eine wandernde dritte Larve aus dem Lebensmittelfläschchen und legen Sie sie auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
10. Füllen Sie die Spitze der Mikropipette aus Glas mit einer kleinen Menge Klebstoff unter Verwendung eines negativen Luftdrucks, der durch den Mund mit Aufsatz erzeugt wird (Schritt 1.5).
11. Positionieren Sie die Larve mit der Rückenseite nach oben mit einer Pinzette und kleben Sie den Kopf mit einem kleinen Tropfen Kleber unter Verwendung von positivem Luftdruck mit dem Mund auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende der Larve und achten Sie darauf, dass das Tier zwischen den beiden Klebeansätzen straff gespannt ist.
13. Mit einer Schere (Klingen 3 mm; Materialtabelle), machen Sie einen horizontalen Schnitt (~1 mm) am hinteren und einen vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
14. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette (#5, Materialtabelle) vorsichtig die dorsale Luftröhre, den Darm, den Fettkörper und andere innere Organe, die die Muskulatur bedecken.
15. Wiederholen Sie den Klebevorgang für die vier Karosseriewandklappen und achten Sie darauf, die Korpuswand sowohl horizontal als auch vertikal sanft zu dehnen.
16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit einer Pinzette an, schneiden Sie die motorischen Nerven vorsichtig mit einer Schere ab und entfernen Sie dann den VNC vollständig.
17. Ersetzen Sie die Dissektionskochsalzlösung durch Ca²⁺-freie Kochsalzlösung (wie die obige Dissektionskochsalzlösung ohne CaCl₂), um den Kreislauf des synaptischen Vesikels (SV) zu stoppen.

>2. Bildgebung: Konfokale Mikroskopie

1. Verwenden Sie ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv, um die NMJ-Farbstofffluoreszenz abzubilden (andere Mikroskope können verwendet werden).
2. Bilden Sie den Muskel 4 NMJ der Bauchsegmente 2-4 ab (andere NMJ können abgebildet werden) und sammeln Sie Bilder mit geeigneter Software (Table of Materials).
3. Verwenden Sie einen HeNe 633 nm Laser, um HRP:647 (mit Langpassfilter > 635 nm) und einen Argon-Laser 488 nm zu stimulieren, um FM1-43 (mit Bandpassfilter 530-600 nm) anzuregen.
4. Bestimmen Sie im Betrieb die optimale Verstärkung und den optimalen Offset für beide Kanäle.
   Anmerkung: Diese Einstellungen bleiben während des restlichen Experiments konstant.
5. Führen Sie einen konfokalen Z-Stapel durch den gesamten ausgewählten NMJ von der HRP-markierten Oberseite nach unten des synaptischen Terminals.
6. Notieren Sie sich den abgebildeten NMJ (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass nach dem Entladen des FM-Farbstoffs genau der gleiche NMJ überschritten wird.

>3. Channelrhodopsin-Stimulation FM-Farbstoffbeladung

1. Aufziehen von ChR2-exprimierenden Larven auf Lebensmitteln, die den ChR2-Co-Faktor all-trans Retinal (gelöst in Ethanol; 100 μM Endkonzentration) enthalten.
2. Legen Sie das Larvenpräparat in die Plexiglaskammer auf einen Dissektionsmikroskoptisch, der mit einem Kameraanschluss ausgestattet ist.
3. Bringen Sie eine blaue LED (470 nm; Tabelle der Materialien) über ein Koaxialkabel an einen programmierbaren Stimulator anschließen und die LED in den Kameraanschluss stecken.
4. Fokussieren Sie den blauen LED-Lichtstrahl mit der Zoomfunktion des Mikroskops auf die Funktion der präparierten Larve.
5. Ersetzen Sie die Ca2⁺-freie Kochsalzlösung auf dem Larvenpräparat durch die oben genannte FM1-43-Kochsalzlösung (4 μM; 1 mM CaCl₂) im optogenetischen Stadium.
6. Stellen Sie die LED-Parameter mit dem Stimulator ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min (Abbildung 2)).
7. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie sie mit einem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode (z. B. 5 min; Abbildung 2).
8. Wenn der Timer stoppt, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch Ca²⁺-freie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen.
9. In schneller Folge mit der Ca²⁺-freien Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um sicherzustellen, dass die FM-Farbstofflösung vollständig entfernt wird.
10. Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2⁺-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem Konfokalmikroskop unter Verwendung des Bildgebungsprotokolls auf.
11. Notieren Sie sich den abgebildeten NMJ (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass Sie nach dem Entladen des FM-Farbstoffs auf genau denselben NMJ zugreifen können.

>4. Channelrhodopsin-Stimulation: FM-Farbstoffentladung

1. Ersetzen Sie die^Ca-2+-freie Kochsalzlösung durch normale Kochsalzlösung (ohne FM1-43-Farbstoff) auf dem Dissektionsmikroskoptisch mit der auf die Larve gerichteten Kameraport-LED.
2. Stellen Sie die Stimulatorparameter für die Entladung ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2).
3. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie sie mit einem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode (z. B. 2 min; Abbildung 2).
4. Wenn die Timer-Periode abgelaufen ist, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch Ca²⁺-freie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen.
5. In schneller Folge mit Ca²⁺-freier Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um sicherzustellen, dass der äußere Farbstoff vollständig entfernt wird.
6. Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2⁺-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem konfokalen Mikroskop auf.
7. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz des FM1-43-Farbstoffs bei demselben oben genannten NMJ mit denselben konfokalen Einstellungen abgebildet wird.

Ergebnisse

Abbildung 1: Flussdiagramm des FM1-43-Farbstoffbeladungsprotokolls am Drosophila NMJ. Die Larvenleimdissektion führt zu einer abgeflachten Neuromuskulaturspräparation, wobei der ventrale Nervenstrang (VNC) segmentale Nerven von der ventralen Mittellinie (Vm) zu den hemisegmental wiederholten Körperwandmuskelarrays projiziert (Schritt a). Das VNC wird freigeschnitten und die gesamte Larvendissektio...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Fisher Scientific	NC9644388	Zum Aufsetzen von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Zum Anlegen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Top-Heizplatte Typ 2200	Thermolyne	HPA2235M	Um den SylGard zu heilen
Präparierkammer aus Plexiglas	N/A	N/A	handgemacht
Kapillaren aus Borosilikatglas	WPI	1B100F-4	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierter Mikropipettenabzieher	Sutter-Instrument	P-2000	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 Laborschlauch	Komponentenversorgung Co.	TET-031A	Für Mund- und Saugpipette
P2 Pipettenspitze	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1111-3700	Für Mundpipette
0,6-ml-Eppendorf-Röhrchenkappe	Fisher Scientific	Tel.: 05-408-120	Wird verwendet, um Klebstoff zum Sezieren einzubringen
Vetbond 3M	WPI	Vetbond	Kleber zum Sezieren
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P-217	Forsalin
Natriumchlorid	Millipore Sigma	Nr. S5886	Für Kochsalzlösung
Magnesiumchlorid	Fisher Scientific	M35-500	Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid-Dihydrat	Millipore Sigma	Nr. C7902	Für Kochsalzlösung
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson Immunforschung	Tel.: 123-605-021	Zur Markierung neuronaler Membranen
HEPES	Millipore Sigma	Nr. H3375	Für Kochsalzlösung
Pinsel	Winsor & Newton	94376864793	Um die Larven zu manipulieren
Dumont Dumostar Pinzette #5	WPI	500233	Wird beim Präparieren verwendet
7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)	WPI	Artikel-Nr.: 14177	Wird beim Präparieren verwendet
FM1-43	Fisher Scientific	Nr. T35356	Fluoreszierender Styrolylfarbstoff
Digitaler Timer	VWR	Tel.: 62344-641	Für das Timing des FM-Färbe-Ladens/Entladens
LSM 510 META Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss		Zur Abbildung der Fluoreszenzmarker
Zen 2009 SP2 Version 6.0	Zeiss		Software für die Bildgebung auf konfokalen
HeNe 633nm Laser	Lasos	Zur Anregung von HRP:647 während der Bildgebung
Argon 488nm Laser	Lasos		Zur Anregung des FM-Farbstoffs während der Bildgebung
Mikro-Schmiede	WPI	MF200	Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
Anreger	Gras	Nr. S48	Zur Steuerung der LED und der elektrischen Stimulation
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Wesentlicher Co-Faktor für ChR2
Zeiss Stemi Mikroskop mit Kameraanschluss	Zeiss	2000-C	Wird während der Stimulation von Channelrhodopsin verwendet
LED 470nm	ThorLabs (Englisch)	M470L2	Wird für die ChR-Aktivierung verwendet
T-Cube LED-Treiber	ThorLabs (Englisch)	LEDD1B	So steuern Sie die LED
LED-Netzteil	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	So schalten Sie die LED ein
Optischer Leistungs- und Energiezähler	ThorLabs (Englisch)	PM100D	So messen Sie die LED-Intensität
40X Achroplan Wasserimmersionsobjektiv	Zeiss	Wird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung verwendet