>1. Sektion von Larvenkleber
- Mischen Sie 10 Teile Silikonelastomerbasis gründlich mit 1 Teil Silikonelastomer-Härter aus dem Elastomer-Kit (Materialtabelle).
- 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit dem Elastomer beschichten und auf einer Heizplatte bei 75 °C mehrere Stunden aushärten (bis sie nicht mehr kleben
).
- Legen Sie ein einzelnes elastomerbeschichtetes Glasdeckglas in die speziell angefertigte Plexiglas-Dissektionskammer (Abbildung 1, unten), um die Larvendissektion vorzubereiten.
- Bereiten Sie die Leimpipetten aus Borosilikatglaskapillare mit einem Standard-Mikroelektrodenabzieher vor, um die gewünschte Verjüngung und Spitzengröße zu erhalten.
- Brechen Sie die Spitze der Mikropipette vorsichtig ab und befestigen Sie am anderen Ende einen flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, ID; 3/32" Außendurchmesser, OD; 1/32" Wand; Tabelle der Materialien) mit Mundanschluss (Pipettenspitze P2).
- Füllen Sie einen kleinen Behälter (0,6 mL Eppendorf-Röhrchenkappe) mit einem kleinen Volumen (~20 μL) Klebstoff (Materialtabelle) zur Vorbereitung der Larvendissektion
.
- Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES) pH 7,2.
- Fügen Sie einen Anti-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Antikörper hinzu, der an Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; 1:10 verdünnt von einem 1 mg/ml-Stamm) konjugiert ist, um das präsynaptische Terminal der neuromuskulären Verbindung (NMJ) während der Dissektion zu markieren.
- Entfernen Sie mit einem feinen Pinsel (Größe 2) eine wandernde dritte Larve aus dem Lebensmittelfläschchen und legen Sie sie auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
- Füllen Sie die Spitze der Mikropipette aus Glas mit einer kleinen Menge Klebstoff unter Verwendung eines negativen Luftdrucks, der durch den Mund mit Aufsatz erzeugt wird (Schritt 1.5).
- Positionieren Sie die Larve mit der Rückenseite nach oben mit einer Pinzette und kleben Sie den Kopf mit einem kleinen Tropfen Kleber unter Verwendung von positivem Luftdruck mit dem Mund auf das elastomerbeschichtete Deckglas.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende der Larve und achten Sie darauf, dass das Tier zwischen den beiden Klebeansätzen straff gespannt ist.
- Mit einer Schere (Klingen 3 mm; Materialtabelle), machen Sie einen horizontalen Schnitt (~1 mm) am hinteren und einen vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
- Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette (#5, Materialtabelle) vorsichtig die dorsale Luftröhre, den Darm, den Fettkörper und andere innere Organe, die die Muskulatur bedecken.
- Wiederholen Sie den Klebevorgang für die vier Karosseriewandklappen und achten Sie darauf, die Korpuswand sowohl horizontal als auch vertikal sanft zu dehnen.
- Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit einer Pinzette an, schneiden Sie die motorischen Nerven vorsichtig mit einer Schere ab und entfernen Sie dann den VNC vollständig.
- Ersetzen Sie die Dissektionskochsalzlösung durch Ca2+-freie Kochsalzlösung (wie die obige Dissektionskochsalzlösung ohne CaCl2), um den Kreislauf des synaptischen Vesikels (SV) zu stoppen.
>2. Bildgebung: Konfokale Mikroskopie
- Verwenden Sie ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv, um die NMJ-Farbstofffluoreszenz abzubilden (andere Mikroskope können verwendet werden).
- Bilden Sie den Muskel 4 NMJ der Bauchsegmente 2-4 ab (andere NMJ können abgebildet werden) und sammeln Sie Bilder mit geeigneter Software (Table of Materials).
- Verwenden Sie einen HeNe 633 nm Laser, um HRP:647 (mit Langpassfilter > 635 nm) und einen Argon-Laser 488 nm zu stimulieren, um FM1-43 (mit Bandpassfilter 530-600 nm) anzuregen.
- Bestimmen Sie im Betrieb die optimale Verstärkung und den optimalen Offset für beide Kanäle.
Anmerkung: Diese Einstellungen bleiben während des restlichen Experiments konstant.
- Führen Sie einen konfokalen Z-Stapel durch den gesamten ausgewählten NMJ von der HRP-markierten Oberseite nach unten des synaptischen Terminals.
- Notieren Sie sich den abgebildeten NMJ (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass nach dem Entladen des FM-Farbstoffs genau der gleiche NMJ überschritten wird.
>3. Channelrhodopsin-Stimulation FM-Farbstoffbeladung
- Aufziehen von ChR2-exprimierenden Larven auf Lebensmitteln, die den ChR2-Co-Faktor all-trans Retinal (gelöst in Ethanol; 100 μM Endkonzentration) enthalten.
- Legen Sie das Larvenpräparat in die Plexiglaskammer auf einen Dissektionsmikroskoptisch, der mit einem Kameraanschluss ausgestattet ist.
- Bringen Sie eine blaue LED (470 nm; Tabelle der Materialien) über ein Koaxialkabel an einen programmierbaren Stimulator anschließen und die LED in den Kameraanschluss stecken.
- Fokussieren Sie den blauen LED-Lichtstrahl mit der Zoomfunktion des Mikroskops auf die Funktion der präparierten Larve.
- Ersetzen Sie die Ca2+-freie Kochsalzlösung auf dem Larvenpräparat durch die oben genannte FM1-43-Kochsalzlösung (4 μM; 1 mM CaCl2) im optogenetischen Stadium.
- Stellen Sie die LED-Parameter mit dem Stimulator ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min (Abbildung 2)).
- Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie sie mit einem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode (z. B. 5 min; Abbildung 2).
- Wenn der Timer stoppt, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch Ca2+-freie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen.
- In schneller Folge mit der Ca2+-freien Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um sicherzustellen, dass die FM-Farbstofflösung vollständig entfernt wird.
- Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2+-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem Konfokalmikroskop unter Verwendung des Bildgebungsprotokolls auf.
- Notieren Sie sich den abgebildeten NMJ (Segment, Seite und Muskel), um sicherzustellen, dass Sie nach dem Entladen des FM-Farbstoffs auf genau denselben NMJ zugreifen können.
>4. Channelrhodopsin-Stimulation: FM-Farbstoffentladung
- Ersetzen Sie dieCa-2+-freie Kochsalzlösung durch normale Kochsalzlösung (ohne FM1-43-Farbstoff) auf dem Dissektionsmikroskoptisch mit der auf die Larve gerichteten Kameraport-LED.
- Stellen Sie die Stimulatorparameter für die Entladung ein (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2).
- Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie sie mit einem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode (z. B. 2 min; Abbildung 2).
- Wenn die Timer-Periode abgelaufen ist, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch Ca2+-freie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen.
- In schneller Folge mit Ca2+-freier Kochsalzlösung waschen (5x für 1 min), um sicherzustellen, dass der äußere Farbstoff vollständig entfernt wird.
- Bewahren Sie die Larvenvorbereitung in frischer Ca2+-freier Kochsalzlösung für die sofortige Bildgebung mit dem konfokalen Mikroskop auf.
- Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz des FM1-43-Farbstoffs bei demselben oben genannten NMJ mit denselben konfokalen Einstellungen abgebildet wird.
