Implantation einer Elektrode in den subthalamischen Kern einer Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Fluri, F., et al., Mikroelektrodengesteuerte Implantation von Elektroden in den subthalamischen Kern von Ratten für die langfristige tiefe Hirnstimulation. J. Vis. Exp. (2015)

Das Video zeigt ein Verfahren zur Implantation einer Elektrode in den subthalamischen Kern einer Ratte, um elektrische Reize zu liefern.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Anästhesie

1. Überprüfen Sie das Anästhesiesystem, um eine ausreichende Versorgung mit Gas (Sauerstoff) und Isofluran für die Dauer des Eingriffs sicherzustellen. Verbinden Sie den Nasenkonus mit dem Schneidezahn des stereotaktischen Instruments und stellen Sie den Schneidezahn auf -3,3 mm ein.
2. Schalten Sie das Zuführgas (2 l/min) ein. Lege die Ratte in eine Schachtel und verschließe den Deckel. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 3,5% ein.
3. Wenn die Ratte liegt, schalten Sie das System so, dass das Narkosegas zum Nasenkonus strömt, der an der Schneidestange befestigt ist.
4. Nehmen Sie die Ratte aus der Kastenkammer und rasieren Sie den Bereich zwischen den Ohren und den Augen. Tupfen Sie die rasierte Stelle mit einem Wattestäbchen, das mit Jodosept PVP getränkt ist, ab, um lose Haare zu entfernen.
5. Positionieren Sie die Ratte im Nasenkonus (Abbildung 1) und setzen Sie die Anästhesie mit Isofluran 2,5% in O₂ (1 L/min) fort. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie den Interdigitalbereich zusammendrücken. Wird die Ratte ausreichend betäubt, werden die Abwehrreflexe (d.h. das Zurückziehen des Fußes) aufgehoben.
6. Überwachen Sie die Atmung und die Reaktion auf die Stimulation während des Eingriffs und stellen Sie den Verdampfer nach Bedarf ein.
7. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Ein rückkopplungsgesteuertes Heizsystem überwacht und hält die Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 °C.

>2. Chirurgie

1. Halten Sie das Operationsfeld während der gesamten Operation steril. Sobald die Hände des Chirurgen und das Operationsfeld steril sind, bewegen Sie sich nur vorsichtig und denken Sie daran, die Sterilität nicht zu brechen. Dazu gehört, dass man ein steriles Feld (z. B. sterile wasserdichte Abdeckungen) hat, auf dem man Instrumente ablegen kann.
2. Injizieren Sie 0,2 ml Mepivacain subkutan in die Mitte des rasierten Bereichs. Mepivacain ist ein Lokalanästhetikum, das eine Wirkungsdauer von bis zu 3 Stunden hat. Es wird das Operationsgebiet weiter betäuben.
3. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie, der zwischen den Ohren beginnt und sich bis zu 2 cm erstreckt. Achten Sie darauf, dass auch das Periost (glänzende Membran unter der Haut) eingeschnitten wird. Legen Sie den Schädel mit vier Klammern frei (Abbildung 2).
4. Entfernen Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig das Periost, bis die koronalen und sagittalen Nähte freiliegen, und stillen Sie danach das Blut mit Watte.
5. Bestimme die Koordinaten des Bregmas mit einer Nadel, die an einem Sondenhalter befestigt ist, und markiere dann die Spitze der Nadel mit einem schwarzen Filzstift. Positionieren Sie die Nadelspitze mit den anterioren/posterioren (AP), Mittellinien-/lateralen (ML) und dorsoventralen (DV) Antriebsschrauben direkt über dem Bregma.
6. Nehmen Sie die Messwerte der AP- und ML-Nonius-Skala: Subtrahieren Sie 3,6 mm vom AP-Messwert und 2,5 mm vom ML-Messwert für die Elektrodenimplantation in den rechten STN oder addieren Sie 2,5 mm für die Elektrodenimplantation in den linken STN. Diese Position wird durch die Färbung des Filzstifts markiert, nachdem die Nadelspitze auf die Oberfläche des Schädels abgesenkt wurde.
7. Klemmen Sie den Dentalbohrer auf den großen Sondenhalter des stereotaktischen Instruments. Bewegen Sie den Zahnbohrer auf die berechnete Fläche – also den markierten Punkt auf dem Schädel. Bohren Sie mit Blick durch das Mikroskop ein Loch (Durchmesser ca. 1 mm) durch den Schädel, bis die Dura sichtbar ist (der Schädel ist ca. 1 mm dick). Ziehen Sie die Dura mit einer Mikrodissektionszange oder einer sterilen Nadel zurück. Die Dura ist zäh genug, um die Spitze der Elektrode zu zerstören.
8. Bohren Sie mit dem Zahnbohrer ein Loch in jedes frontale Squam und in das interparietale Squama gegenüber dem Elektrodenloch. Trennen Sie den Sondenhalter vom stereotaktischen Instrument. Bohren Sie nicht an einer Schädelnaht, da venöse Gefäße den Nähten unter dem Schädel folgen.
9. Schrauben Sie in jedes der fünf Löcher eine Knochenschraube. Vermeiden Sie es, die Schrauben zu tief einzuschrauben. Bei Edelstahlschrauben (M1.6) reichen 2-3 Umdrehungen der Schraube aus, um die Schraube ausreichend zu halten, ohne Druck auf das Gehirn auszuüben. Die Anzahl der Umdrehungen hängt von der Steigung der Schraube ab. Klemmen Sie den Sondenhalter mit der Elektrode in den Mikromanipulator (Abbildung 3).
10. Bewegen Sie den Sondenhalter mit den Antriebsschrauben AP, ML und DV mit der Elektrode, bis die Spitze fast das Bregma berührt. Beachten Sie die Messwerte der AP-, ML- und DV-Nonius-Skala am Bregma. Wenn die Messungen durchgeführt wurden, heben Sie die Elektrode einige Millimeter an, um zu verhindern, dass die Elektrode während der Bewegung den Schädel abkratzt. Um die Koordinaten der Position zu bestimmen, an der die Elektrode in das Loch eingeführt werden muss, addieren Sie 3,6 mm zum AP-Messwert und addieren (oder subtrahieren) Sie 2,5 mm zum ML-Messwert.
11. Bewegen Sie die Elektrode mit den Antriebsschrauben AP und ML in die berechnete Position. Zu diesem Zeitpunkt sollte sich die Elektrodenspitze direkt über dem gebohrten Elektrodenloch befinden. Senken Sie dann die Elektrode durch das Mikroskop auf die Höhe der Dura ab (Abbildung 4). Dieser Pegel dient als Nullpegel in DV-Richtung. Führen Sie danach die Spitze der Elektrode vorsichtig in das Gehirn ein, indem Sie durch das Mikroskop schauen.
12. Verbinden Sie den Elektrodenstift mit dem Anschluss des Aufnahmesystems. Platzieren Sie einen Faradayschen Käfig (oder ersetzen Sie ihn durch Aluminiumfolie) über der Ratte im stereotaktischen Instrument (Abbildung 5). Erden Sie das stereotaktische Instrument mit dem Gegengewicht des Raumes, in dem gearbeitet wird.
13. Starten Sie das Aufnahmesystem. Falls vorhanden, verwenden Sie auch einen Lautsprecher, um ein akustisches Signal von Entladungen/Salben einzelner Einheiten zu erhalten, während die Elektrode vorgeschoben wird.
14. Führen Sie die Elektrode langsam in das Gehirn ein, indem Sie die elektrische Aktivität aufzeichnen, während Sie die Elektrode vorschieben. In einer Tiefe zwischen 7,5 und 8,1 mm von der Dura ist die spezifische elektrische Aktivität des STN in der Regel nachweisbar (Abbildung 6). Die typische Aktivität von Neuronen im STN ist durch ein unregelmäßiges Feuermuster und eine hohe Feuerrate gekennzeichnet (mittlere Frequenz: 40,9 ± 12,9 Hz).
15. Reduzieren Sie während der Aufzeichnung die Anästhesie so weit wie möglich (z. B. auf 0,8–1,0 %); niedrig narkotisierte Tiere zeigen eine deutlichere elektrische Gehirnaktivität.
16. Tupfen Sie jegliches Blut oder Liquor cerebrospinalis ab, das beim Absenken der Elektrode von der Schädeloberfläche verdrängt wurde.
17. Mischen Sie eine kleine Menge Zahnzement und tragen Sie ihn mit einem kleinen Spachtel um die Elektrode und um vier der fünf Schrauben auf (Abbildung 7). Die fünfte Schraube wird verwendet, um das Erdungskabel des Steckers zu befestigen.
18. Trennen Sie den Elektrodenstift vom Elektrodenhalter und schließen Sie das Aufzeichnungssystem an, wenn der Zahnzement fixiert ist.
19. Lösen Sie die Schraube, die nicht mit Zahnzement fixiert wurde. Stecken Sie den Stecker auf den Elektrodenstift. Befestigen Sie das Erdungskabel des Steckers mit der fünften Schraube (Abbildung 8).
20. Mischen Sie Zahnzement und tragen Sie ihn um den Stöpsel herum auf. Wenn der Zement eindickt, forme ihn um den Stopfen, um eine Kappe zu bilden. Vermeiden Sie scharfe Kanten des Zahnzementes, die das Tier schädigen könnten, und entfernen Sie diese während der Aushärtung (Abbildung 9A und B).
21. Die Wundränder entbräuden und mit einer Naht vorne und hinter der Kappe verschließen. Desinfizieren Sie anschließend die Wundränder.
22. Verbinden Sie den Kopfstecker mit dem Kabel, das an einem Drehgelenk befestigt ist. Entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Instrument.
23. Tragen Sie Tramadol (12,5 mg/kg, intraperitoneal) am Ende des Eingriffs und dann einmal täglich für 2-3 Tage auf. Setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig mit thermischer Unterstützung, befestigen Sie den Wirbel an diesem Käfig (Abbildung 10) und untersuchen Sie ihn 1 Stunde lang sorgfältig.
24. Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1. Fixierung des Kopfes im stereotaktischen Instrument. Die Ratte wird sowohl durch die Ohrstangen des stereotaktischen Rahmens, als auch durch die Gasanästhesiemaske fixiert.

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Abbildung 2. Den Schädel freilegen. Nac...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pt/Ir-Elektrode	FHC Inc.	UE	Sonderanfertigung: Spezifikation: UEPSEGSECN1M
Stecker	GT Labortechnik (Arnstein/Deutschland)
Stiftleiste	DISTRELEC	Tel.: 143-95-324	einreihig, 90° 1x3 Datamate, Typ M80-8420342
Steckdose	DISTRELEC	Tel.: 143-95-621	einreihig, gerader 2 mm Pol Nr.1x3 Datamate, Typ M80-8400342
Feder aus rostfreiem Stahl	Kunststoffe ONE	SS0102	Teile-#: .120 X .156 Feder ID (mm): 3.0 Feder AD (mm): 4.0
Zahnzement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Flüssigkeit, 500 ml
Zahnzement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Pulver, Rose, 500g
Kopfschraube	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1,6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Adrenalin	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochlorid	Rotexmedica		Artikel-Nr.: 38449.00.00