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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung des Tieres:
- Betäuben Sie die Ratte mit einem Inhalationsmittel (Isofluran) in einer Menge von 1-2%, das zur Wirkung oder durch Injektion (Ketamin, Xylazin, Acepromazin) verabreicht wird. Die Dosierung der injizierbaren Anästhesie ist wie folgt: 95,0 mg/kg Ketamin, 10,0 mg/kg Xylazin, 0,075 mg/kg Acepromazin.
Anmerkung: Bei der Durchführung dieses CMAP-Aufzeichnungsprotokolls verwenden wir erfolgreich sowohl inhalative als auch injizierbare Anästhetika, ohne Präferenz.
- Das Tier muss vor Beginn der Operation, bis zum Abschluss der Operation und bis zum Wirken von postoperativem Buprenorphin in der entsprechenden Anästhesietiefe gehalten werden. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie, indem Sie kurz in die Zehen kneifen, um festzustellen, dass keine Entzugsreaktion ausgelöst wird. Testen Sie zusätzlich den Hornhautreflex mit einem Wattestäbchen. Stellen Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs fest, dass die Herzfrequenz und die Atemfrequenz nicht gestiegen sind, was darauf hindeutet, dass die Anästhesietiefe zu gering geworden ist.
- Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen des Tieres auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Der Chirurg sollte sich vor Beginn der Operation die Hände mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin-Peeling) waschen. Der Chirurg sollte sterile Handschuhe, eine Gesichtsmaske und einen Kittel oder einen sauberen Laborkittel tragen. Alle Instrumente sollten vor der Operation gewaschen und autoklaviert werden. Fügen Sie vor dem Autoklavieren auf Höhe der Instrumente einen Sterilisationsindikatorstreifen in das Instrumentenset ein, um zu überprüfen, ob die Sterilisation abgeschlossen ist. Der Chirurg sollte vor Beginn der Operation überprüfen, ob die gesamte Linie auf dem Streifen schwarz ist. Kleben Sie die Außenseite der Box ebenfalls mit dem Autoklavenband ab. Wenn mehrere Tiere am selben Tag operiert werden sollen, reinigen Sie die Instrumente zwischen den Operationen und sterilisieren Sie sie in einem Glasperlensterilisator. Falls erforderlich, sterilisieren Sie beide Enden des Instruments im Glasperlensterilisator, indem Sie den Griff des Instruments für die entsprechende Zeit in den Sterilisator legen, das Instrument mit einem sterilen Hämostaten entfernen, es in einem sterilen Feld abkühlen und dann das funktionelle Ende des Instruments für den entsprechenden Zeitraum in den Glasperlensterilisator legen.
- Sobald das Tier betäubt ist, legen Sie es mit der Rückenfläche nach unten und dem Bauch nach oben auf das Operationsbrett, damit das Klebeband verwendet werden kann, um die Vordergliedmaßen des Tieres am Operationsbrett zu befestigen.
- Rasieren Sie die Bauchfläche kaudal, beginnend an der Schädelbasis, und stellen Sie sicher, dass der Bereich um den Bauch auf beiden Seiten der Mittellinie rasiert wird, je nachdem, welches Hemi-Zwerchfell aufgenommen wird. Tragen Sie Povidon-Jod auf die rasierte Hautoberfläche auf.
>2. Vorbereitung für CMAP-Aufnahmen:
- Nach der Vorbereitung des Tieres wird die Masseelektrode subkutan in den Schwanz eingeführt (Abbildung 1).
- Legen Sie die Referenzelektrode subkutan in den kontralateralen Unterbauchbereich.
- Legen Sie das leitfähige Gel auf den selbstklebenden Oberflächenstreifen oder die Disk-Aufzeichnungselektrode (Abmessungen der Oberflächenstreifenelektrode: 0,5 x 3 cm) und platzieren Sie die Oberflächenelektrode dann quer entlang des einseitigen Rippenrandes.
- Platzieren Sie die Stimulationselektroden transkutan in einem Abstand von 0,5 cm lateral der Luftröhre und oberhalb des Schlüsselbeins. Führen Sie die Elektroden ca. 1,0 cm tief durch die Haut ein. Befestigen Sie die Elektroden mit der Hand, damit sich ihre Position bei nachfolgenden Stimulationen nicht verschiebt.
Anmerkung: Stimulierende Elektroden in einem Winkel von 90° zur Haut an der Einführstelle.
>3. Aufzeichnungen des zusammengesetzten Muskelaktionspotentials (CMAP):
- Erhalten Sie elektrophysiologische Aufzeichnungen mit einem Stimulator/Verstärker, gefolgt von einer computergestützten Datenanalyse.
- Die Stimulusparameter der Einzelzugstimulation sollten 0,5 ms und supramaximale Impulse von 1,0 Hz betragen. Die Amplitude des Stimulus sollte zwischen 6,0 und 8,0 V liegen (Abbildung 2A).
Anmerkung: Verwenden Sie in einem Experiment eine Reizintensität mit der gleichen Amplitude für Tiere. Ziel ist es, die Reaktionsamplitude durch die Verwendung der minimalen Stimulationsamplitude zu maximieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die erste Reaktion, die zum Zeitpunkt der Stimulation auftritt, ein Stimulationsartefakt ist. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, dass eine CMAP-Antwort erhalten wird, der nach dem Stimulationsartefakt eine stabile/flache Basislinie vorausgeht, auf die dann die schnelle CMAP-Antwort folgt. Um eine solche Reaktion zu erzielen, kann es erforderlich sein, die Stimulations- und/oder Aufzeichnungselektroden neu zu positionieren.
- Warten Sie 30 Sekunden zwischen den Stimulationen und wiederholen Sie 10 Stimulationen hintereinander, um die durchschnittliche Reaktion zu erhalten (Abbildung 2B-C). Messen Sie die Amplitude von der Grundlinie bis zur Spitze (Abbildung 2A). Führen Sie die Stimulation des Nervus phrenicus während der Phase des Atemzyklus des Tieres durch, wenn der Nervus phrenicus/das Zwerchfell nicht aktiviert ist. Die Prozedur kann am selben Tier für das kontralaterale Halbdiaphragma wiederholt werden.
- Nach der abschließenden CMAP-Aufnahmesitzung wird das Tier perfundiert, wenn eine Färbung des neuromuskulären Zwerchfellübergangs (NMJ) durchgeführt wird. Führen Sie CMAP-Aufzeichnungen an demselben Tier etwa einmal pro Woche (oder in Intervallen Ihrer Wahl) durch.
- Lassen Sie das Tier nach den Überlebens-CMAP-Aufzeichnungen auf einem zirkulierenden Warmwasser-Heizkissen erholen und überwachen Sie es während der Genesung kontinuierlich, bis es wach und streng liegt. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.
Sobald Sie sich - mit dem Heck hingelegt haben, überwachen Sie das Tier in den ersten 48 Stunden alle 12 Stunden (danach einmal täglich). Wenn das Tier dehydriert zu sein scheint (schlaffe Haut, Antriebslosigkeit), verabreichen Sie Flüssigkeiten (Laktatlösung; subkutan; 1-2 ml pro Injektion, wobei die Stellen gewechselt werden; 2 Mal pro Tag), bis sich der postoperative Gewichts- und Flüssigkeitsverlust stabilisiert hat. Geben Sie den Tieren während der akuten postoperativen Phase bei Bedarf weiches Futter in kleinen Schüsseln, um das Fressen zu fördern, wenn sie den Futterautomaten nicht erreichen können.
- Verabreichen Sie Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 mg/kg vor dem Ende der Operation und dann in den ersten 24 Stunden in Abständen von 12 Stunden (und danach abhängig von Anzeichen von Schmerzen/Stress) durch subkutane Injektion (Stelle gedreht). Wenn danach Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden festgestellt werden, sind die Tiere mit Buprenorphin zu behandeln. Zu den Anzeichen, die auf Schmerzen/Leiden hinweisen, gehören mangelnde Aktivität, Lautäußerungen, Mangel an Essen oder Trinken (Dehydration), übermäßiger Gewichtsverlust, Bewachung, übermäßiges Nagen oder Kratzen an der Einschnittstelle. Zusätzliche Kriterien, die zur Bestimmung von Schmerzen und Leiden herangezogen werden, sind Unempfindlichkeit auf äußere Reize, vorübergehende oder unprovozierte Lautäußerungen, angestrengte oder abnormale Atmung, anhaltender rötlich-brauner nasookkulärer Ausfluss und ausgeprägte Piloerektion. Überwachen Sie auch Anzeichen von mangelnder Hygiene, die auf kranke Tiere hindeuten würden. Wenn das Tier nach 72 Stunden Behandlung immer noch in Not ist (gemäß den oben beschriebenen Schmerz-/Stresskriterien und nach Erhalt des oben beschriebenen Analgetikum-Protokolls), schläfern Sie das Tier ein.
