im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Quelle: Hancock, C. E. et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

Protokoll

>1. Transgene Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster

1. Kreuzen Sie weibliche jungfräuliche und männliche Fliegen (aufgezogen bei 25 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus), die die gewünschten Gal4- bzw. UAS-Konstrukte tragen, um Fliegen zu produzieren, bei denen bestimmte Neuronen von Interesse einen genetisch kodierten Kalziumindikator exprimieren.
2. Lassen Sie die weiblichen Nachkommen der obigen Kreuzung altern, bis sie sich im Bereich von 3-6 Tagen nach der Eklosion befinden. Weibliche Fliegen sind wegen ihrer etwas größeren Größe vorzuziehen.

2. Vorbereitung der Fruchtfliege für die in vivo Calcium-Bildgebung

1. Wählen Sie eine einzelne weibliche Fliege aus und betäuben Sie sie nicht länger als 5 Minuten auf Eis.
2. Legen Sie die Fliege mit einer feinen Pinzette in die Bildgebungskammer (siehe Abbildung 1c). Stellen Sie sicher, dass der Brustkorb und die Beine mit den elektrischen Drähten am Boden der Kammer in Kontakt kommen und dass der Kopf flach liegt. Fixieren Sie die Position der Fliege mit durchsichtigem Klebeband.
   Anmerkung: Dieses Protokoll erfordert eine speziell angefertigte Kammer, in der die Fliegen fixiert sind, wobei die Kopfkapsel zum Öffnen zugänglich ist und die Fliegen in der Lage sind, sowohl Geruchsstimulationen an den Antennen als auch elektrische Schocks an den Brustkorb und die Beine zu empfangen (Abbildung 1).
3. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Skalpellklinge, die am Skalpellgriff befestigt ist (siehe Materialtabelle), ein Fenster in das Klebeband um den Kopf der Fliege, so dass die Antennen bedeckt bleiben und nur der vorderste Teil des Thorax freiliegt.
4. Umgeben Sie die Seiten und den Hinterkopf mit blaulichthärtendem Kleber, der vorsichtig mit einem Insektenstift bearbeitet wird, der von konkav-konvexen Kiefern gehalten wird. Den Kleber mit einer blauen LED-Lampe aushärten.
5. Vergewissern Sie sich, dass der Kleber vollständig ausgehärtet ist, und entfernen Sie alle nicht ausgehärteten Kleberreste von der Rückenfläche des Fliegenkopfes.
6. Tragen Sie einen Tropfen Ringer-Lösung (siehe Materialtabelle) auf, um die freiliegende Nagelhaut des Kopfes zu bedecken.
7. Schneide mit einem sehr feinen Stichmesser durch die Nagelhaut. Für eine möglichst effiziente Entfernung der Nagelhaut schneiden Sie zuerst quer über den hinteren Teil des Kopfes, wobei Sie die Augenflecken als Ausgangspunkt verwenden. Schneiden Sie dann jede Seite medial zu den Augen auf, um einen Lappen der Nagelhaut zu bilden, der leicht mit einer Pinzette abgerissen werden kann.
8. Entferne überschüssige Nagelhaut, die die interessierende Gehirnregion blockieren könnte.
9. Reinigen Sie die dorsale Oberfläche vorsichtig mit einer feinen Pinzette von der Luftröhre, um eine Störung des Hirngewebes selbst zu vermeiden. Entfernen und frischen Sie die Ringer-Lösung (siehe Materialtabelle) nach Bedarf auf, um den Bereich von Geweberesten zu befreien.
10. Platzieren Sie die Nadel zur Abgabe von Gerüchen in einer Position von ca. 1 cm vom Kopf der Fliege entfernt. Stellen Sie sicher, dass es nichts gibt, was die Geruchsabgabe an die Antennen behindern könnte.
11. Verbinden Sie am Mikroskop die Bildgebungskammer über die subkutane Geruchsabgabenadel mit dem Geruchsabgabesystem.
12. Damit sich die Fliege vollständig von der Narkose und der Operation erholen und sich an den Luftstrom anpassen kann, sollten Sie in dieser Phase eine Ruhephase von 10 Minuten einlegen.

>3. In-vivo-Calcium-Bildgebung

1. Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Infrarotlaser und einem Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist (siehe Materialtabelle), das auf einem schwingungsisolierten Tisch installiert ist. Für die Visualisierung von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)-basierten Calciumindikatoren stellen Sie den Laser auf eine Anregungswellenlänge von 920 nm ein und installieren einen GFP-Bandpassfilter.
2. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die gewünschte Gehirnregion. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um den Scanvorgang nur auf diesen Bereich zu fokussieren, die Scanzeit zu minimieren und die Scanansicht so zu drehen, dass der vordere Teil des Kopfes nach unten zeigt.
3. Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px an, die Scangeschwindigkeit auf > 4 Hz und den Scanbereich (in der Y-Dimension) so, dass die interessierenden Neuronen abgedeckt sind.

>4. Visualisierung von geruchsevozierten Kalziumtransienten durch olfaktorische Konditionierung

1. Verwenden Sie ein Geruchsabgabesystem, das mehrere Geruchsreize zeitgenau abgeben kann.
   1. Verwenden Sie einen zusätzlichen Computer, um das Gerät zu steuern und mit der Software des bildgebenden Mikroskops zu kommunizieren, um Geruchsstimulationen mit der Bildaufnahme während der Experimente zu koordinieren.
   2. Initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das in der Lage ist, die Bildaufnahmesoftware und das Geruchsabgabeprogramm zu verknüpfen (z. B. ein VBA-Makropaket, das in der Mikroskopsteuerungssoftware installiert ist, siehe Materialtabelle), das auf einen externen Eingangsauslöser reagiert, der durch die Initiierung eines Geruchsabgabeprotokolls in einem separaten Programm bereitgestellt wird).
2. Beginnen Sie die Messung, indem Sie "Pre-Training"/naive geruchsevozierte Calciumtransienten bei einer Auflösung von 512 x 512 px und einer Bildrate von 4 Hz überwachen. Liefern Sie einen Geruchsstimulus von 2,5 s, flankiert von einer zusätzlichen Bildaufnahme für 6,25 s vor dem Geruchsbeginn (um einen F 0-Ausgangswert zu ermitteln) und 12,5 s nach dem Geruchsoffset. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Odorant und dann mit einem dritten Odorant.
3. Fahren Sie 3 min nach dieser Messung mit der klassischen Konditionierung ("Training") der Fliege fort.
   1. Wählen Sie einen der Düfte aus, die in der "Vortrainings"-Phase präsentiert werden, um zum konditionierten Stimulus (CS⁺) zu werden, und einen anderen, um zum CS-Geruch zu werden. Präsentieren Sie den CS⁺ Geruch mit dem computergesteuerten Odor-Delivery-System für 60 s neben zwölf 90 V Elektroschocks.
   2. Nach einer Pause von 60 s ist der ^CS-Geruch 60 s lang allein zu halten. Als Geruchsstoffe sind 4-Methylcyclohexanol und 3-Octanol zu verwenden. Präsentieren Sie den dritten Geruchsstoff (z. B. 1-Octen-3-ol) während dieses Trainings nicht, da er nur vor (Schritt 4.2.) und nach (Schritt 4.4) der Trainingsphase als Kontrolle verwendet wird.
4. Messen Sie die geruchsevozierten Kalziumtransienten "nach dem Training" erneut, indem Sie das Geruchsstimulationsprotokoll "vor dem Training" (Schritt 4.2.) 3 min nach Beendigung der Trainingsphase (Schritt 4.3) wiederholen.
   Anmerkung: Der Zeitpunkt dieses Schritts sollte die interessierende Zeit nach der Gedächtnisbildung widerspiegeln (z. B. führen Sie diesen Schritt 3-4 Minuten nach dem Konditionierungsschritt durch, um das Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen). Typischerweise können Fliegen in dieser Zubereitung mehrere Stunden überleben.
5. Speichern Sie Bilddateien in einem geeigneten Format (z. B. Tiff) für die spätere Bildanalyse.

>5. Bildanalyse

1. Um Bilder zu analysieren, öffnen Sie Tiff-Dateien (oder ähnliche) in der Bildanalysesoftware wie z. B. Fiji.
2. Richten Sie die Stapel mit einem Bewegungskorrekturalgorithmus aus, um minimale Bewegungen in X- und Y-Richtung zu gewährleisten. Verwerfen Sie alle Aufnahmen, die eine starke Bewegung auf der Z-Achse zeigen.
3. Wählen Sie das Software-Tool aus, mit dem ein Bereich of Interest (ROI) um den zu untersuchenden Bereich markiert wird. Diese sollte so präzise wie möglich sein, um den Einfluss der Hintergrundfluoreszenz zu begrenzen.
4. Verwenden Sie das entsprechende Software-Tool, um Daten zur temporalen Fluoreszenzintensität als Dateien aus dem ausgewählten ROI zu extrahieren, so dass für jedes Bild der Aufzeichnung ein Wert generiert wird.
5. Öffnen Sie die Daten mit einem Datenanalyseprogramm, um die ΔF/F_0-Werte für jede Geruchsspur zu berechnen. F₀ = mittlere Fluoreszenz in den 2 s vor Geruchsbeginn. ΔF = die Differenz zwischen der Rohfluoreszenz in einem gegebenen Rahmen und F₀. Berechnen Sie aus diesen Werten einen ΔF/F_0-Wert für jedes Frame, der gegen die Zeit aufgetragen werden kann, um die relative Fluoreszenz während der gesamten Geruchsreizperiode widerzuspiegeln.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau einer Montagekammer und Vorbereitung einer Fliege für die Bildgebung.a) Schritte für den Bau der Fliegenmontagekammer. Die Basis besteht aus einem Standard-Objektträger (1), der mit einem feinen Kunststoffnetz (2) überzogen ist. Zwei elektrische Drähte, die entgegengesetzte Ladungen (3) führen, sind auf beiden Seiten mit dem Schlitten verklebt. Die Drähte werde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. O5284	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	218405	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	153095	Chemikalie, die als Odorierungsmittel verwendet wird
Bandpassfilter für EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland
Durchsichtiges Klebeband	Tesa SE, Norderstedt, Deutschland		Standard durchsichtiges Klebeband
Konkav-konvexe Backen	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	Nr. 10053-09	Klingenhalter mit konkav-konvexen Backen
Feine Pinzette	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	Nr. 11412-11	Pinzette mit Spitze 0,1 x 0,06mm
Injektionsnadel	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Deutschland	4665120	1,20 x 40 mm
Insekten-Minutien-Stecknadeln	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	Artikel-Nr.: 26002-10	Durchmesser 0,1 mm, Spitze 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Großbritannien	953683	Blaulichthärtender Kleber
Objektträger für Mikroskop	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	656,1	Standard-Objektivschlitten 76 x 26 mm
Mineralöl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	M8410	Wird als Verdünnungsmittel für Odoriermittel verwendet
Modengekoppelter Ti-Saphir-Laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA		Abstimmbarer Infrarot-Femtosekundenlaser
Multiphotonenmikroskop LSM 7MP ausgestattet mit BiG-Detektoren	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland		Multiphotonenmikroskope, mehrere Unternehmen bieten ähnliche Geräte an.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) Wasserimmersionsobjektiv	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland	Artikel-Nr.: 421452-9900-000	Objektiv W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Die Lösung von Ringer	n.a.	n.a.	5 mM KCl, 130 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM Hepes-NaOH, 36 mM Saccharose, pH = 7,4
Stichmesser	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	Nr. 72-1551	5,0 mm gerade begrenzte Klingentiefe
Chirurgische Skalpellklinge	Swann-Morton, Sheffield, Vereinigtes Königreich	303	Artikel-Nr. 11
Griff des chirurgischen Skalpells	Swann-Morton, Sheffield, Vereinigtes Königreich	907	Artikel-Nr.: 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA)-Software, um einen Auslöser von der Geruchsabgabevorrichtung und dem Elektroschock-Anwendungsgerät (Stromversorgung) zu erhalten, um mit der ZEN-Software von Zeiss zu interagieren, die das Mikroskop steuert.	Individuell angefertigt und auf Anfrage erhältlich	n.a.	n.a.

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