Ultraschallinduzierte Neuromodulation mit Hilfe eines Mikroelektrodenarray-Systems

Abstract

Quelle: Liang, R. et al., Fokussierte Ultraschall-Neuromodulation von menschlichen In-vitro-Neurokulturen in Multi-Well-Mikroelektrodenarrays. J. Vis. Exp. (2024)

Dieses Video demonstriert die Methode zur Induktion der Modulation der neuronalen Aktivität in kultivierten menschlichen iPSC-abgeleiteten Neuronen in einem Multi-Well-Mikroelektrodenarray oder MEA-System unter Verwendung eines fokussierten Ultraschallwandlers.

Protocol

>1. Vorbereitung der Materialien

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium und verwenden Sie es, um eine einzelne Vertiefung in einer 24-Well-Neuronenkulturplatte mit einem eingebetteten Mikroelektrodenarray (MEA) zu füllen (Abbildung 1A).
2. Sterilisieren Sie die Parafilm-Grenzfläche, das Gummiband und den fokussierten Ultraschall (FUS)-Kegel mit seiner Gummimembran 10 Minuten lang mit 70 % Ethanol und legen Sie sie für die spätere Montage in den Abzug.
3. Entgasen Sie 300 mL entionisiertes Wasser und 50 mL Kupplungsgel. Zentrifugieren Sie das Wasser und das Gel bei 160 x g für 5 Minuten, um Kavitation im Koppelmedium zu vermeiden.
   Anmerkung: Die ursprüngliche Quelle der humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) stammt aus GM01582- und CIPS-Zelllinien. Im Durchschnitt kann eine Dichte von 5 x 10⁴ Motoneuronen und 2,5 x 10⁴ Astrozyten pro Vertiefung erreicht werden.

>2. Anschluss und Einrichtung der Peripherie

1. Befestigen Sie den FUS-Konus mit Schrauben am Schallkopf und versiegeln Sie den Konus mit einer flexiblen Gummimembran in einer belüfteten sterilen Haube. Füllen Sie den Kegel mit dem entgasten und deionisierten (DG-DI) Wasser aus Schritt 1.3 und stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Kegel vorhanden sind, um Kavitation zu vermeiden.
2. Verwenden Sie eine kundenspezifische Gewindestange, um den 3D-gedruckten Halter an einem Rahmen zu befestigen (Abbildung 1B). Positionieren Sie den Rahmen so, dass sich der Kopf des FUS-Wandlers über der Vertiefung befindet, die stimuliert werden soll.
3. Verwenden Sie ein Gummiband, um den Parafilm über der Vertiefung auf der 24-Well-MEA-Platte zu befestigen, die das Medium und die HiPSCs enthält.
4. Bereiten Sie das FUS-System vor, indem Sie die Back-End-Treiberelektronik des Ultraschallwandlers, in diesem Fall die Schallkopfausgangsleistung (TPO), an eine 100-240-V-Steckdose anschließen und das passende Netzwerk mit dem TPO und dem FUS-Schallkopf verbinden. Das passende Netzwerk sorgt für eine effiziente elektrische Kopplung zwischen dem Wandler und dem TPO.
5. Schließen Sie das MEA-System an eine Steckdose (100-240 V) an (Abbildung 2B, Anschluss 5). Verbinden Sie den Synchronisationsport des MEA-Systems mit dem TPO (Abbildung 2B, Anschluss 3). Diese Verbindung synchronisiert die Datenerfassung durch das MEA-System mit der FUS-Stimulation.
6. Setzen Sie die 24-Well-MEA-Platte in das MEA-System ein und entfernen Sie den Deckel, um einen direkten Kontakt zwischen dem Schallkopf und dem Well-System zu ermöglichen. Platzieren Sie den Schallkopf 5-10 mm über der Well-Platte, um Platz für das entgaste Koppelgel zu schaffen, wie in Schritt 3.2 beschrieben (Abbildung 2A und Abbildung 1B).

>3. Stimulation und neuronale Signalerfassung

1. Stellen Sie die FUS-Parameter auf dem TPO-Bedienfeld ein (Tabelle 1).
2. Tragen Sie das Kupplungsgel auf den Parafilm auf und senken Sie den FUS-Wandler in das Kopplungsgel ab, um den Kontakt mit dem Gel mit minimalen Luftblasen sicherzustellen (Abbildung 1A).
3. Starten Sie die Aufzeichnung des MEA-Systems, indem Sie auf der Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Start klicken.
4. Starten Sie die FUS-Beschallung, indem Sie die untere rechte Taste am TPO drücken (Abbildung 2A, Etikett 7), und warten Sie mindestens 5 Minuten zwischen jeder Beschallungsrunde, damit die Neuronen in einen Ausgangszustand zurückkehren können.
5. Verwenden Sie den vom FUS-System erzeugten Triggerimpuls, um die FUS-Stimulationssequenz mit der MEA-Aufzeichnung abzugleichen (Abbildung 1B, Anschluss 3).

Tabelle 1: Parameter für fokussierten Ultraschall (FUS) auf dem TPO eingestellt

Parameter	Wert
Maximale Leistung/Kanal	1.200 W
Aktual	0,749 W/Kanal
ISPPA	10,79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Länge des Bursts	0,100 ms
Frequenz	250,00 kHz
Brennpunkt	39.800 mm
Periode	20.000 ms
Zeitschaltuhr	60.000 s

Results

Abbildung 1: FUS-Neuromodulation mit einem Multiwell-Mikroelektrodenarray (MEA). (A) Schematische Darstellung des Aufbaus für die FUS-Neuromodulation mit einem Multi-Well-MEA. Die vom FUS-Wandler erzeugten Schallwellen breiten sich durch einen mit entgastem Wasser gefüllten FUS-Kegel aus und werden mit Ultraschallgel gekoppelt. Der Parafilm wird mit einem Gummiband an der Bohrung ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEA-Anlage	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Abtastrate: 11500 Hz
MEA-Platte	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Elektrode und Well: 16 Elektroden in 24 Wells
Well-Platten-Schnittstelle	Amcor Inc.	Parafilm PM996; Nr. P7793	Dicke: 127 μm
CO2-Tank und Regler für die Kultur	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Konzentration: 5%
Kulturmedien	ThermoFisher Inc.	Laminin; 23017-015	Konzentration: 1 μg/mL
HiPSC-Neuronen	Peprotech	CIPS und GM01582 abgeleitet; 450-10	Konzentration: 10 ng/ml (Siehe Taga et al. [2021]13)
Absolutwertübertrager	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Mittenfrequenz: 250 kHz
Matching-Netzwerk	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedanz: 50 Ω
Leistungsabgabe des Wandlers (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Version 4.1; 020	Frequenz: von 250 kHz bis 2,5 MHz
Membran	McMaster Inc.	Silikonkautschuk; 5542N115	Dicke: 0,0127 cm
Kupplungs-Gel	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viskosität: 130.000–185.000 Cops
Anschluss an Sondenhalter	McMaster Inc.	Stahlstahl Gewindestange; 90322A661	Länge: 1–1/2" lang
Hydrophon	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Bereich: 50 kHz–1,9 MHz
Wassertank	Sonic Concepts Inc.	Wt	Größe: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Wasseraufbereitung	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Strömungsgeschwindigkeit: 50 mL/s maximal
Oszilloskop	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Abtastrate: Bis zu 50 MHz
Bühne	Sonic Concepts Inc.	Mikrotisch; 2	Genauigkeit: 1 μm
Thermochromes Blech	TIPTEMP Inc.	Flüssigkristall-Folie; TLCSEN337	Messbereich: 22–24 °C
Computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3,7 GHz
Software für die Datenübertragung	Mathworks Inc.	MATLAB (Englisch)	Fassung 2021b
Software zur Verarbeitung	Python-Software-Stiftung	Python	Version 3.7.10