>1. Einrichtung vor den Aufnahmen
- Die Aufzeichnungslösungen sind mit den in Tabelle 1 angegebenen Ionenkonzentrationen herzustellen.
- 15 mL 2 M Stammlösungen in Reinstwasser für MgCl2, CaCl2, KCl und CsCl herstellen.
- Die festen Bestandteile für 100 mL der intrazellulären und 500 mL der extrazellulären gepufferten Lösungen gemäß Tabelle 1 werden in getrennte Becher gewogen und anschließend die jeweilige Menge der vorbereiteten Stammlösungen zugegeben. Verwenden Sie beispielsweise für den intrazellulären Puffer 0,3803 g (10 mM) EGTA (Ethylenglykoltetraessigsäure), 0,2383 g (10 mM) HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure) und 0,6428 g (110 mM) NaCl und fügen Sie 100 μl der 2 M MgCl2 und CaCl2 sowie 50 μl der 2 M KCl- und CsCl-Stammlösungen hinzu.
- Fügen Sie Reinstwasser hinzu und stellen Sie den pH-Wert vorsichtig mit Säuren und Basen ein, die die Messung nicht beeinträchtigen, d.h. nicht von den ChR (Channelrhodopsinen) geleitet werden, wie Zitronensäure und N-Methyl-D-Glukamin (NMG+).
- Die Osmolarität wird auf 290 mOsm für die intrazelluläre und auf 320 mOsm für die extrazellulären Lösungen mit Glukose eingestellt.
Anmerkung: Leicht hypoosmotische intrazelluläre Lösungen erhöhen die Erfolgsrate des Patchings.
- Sterilfiltrieren Sie alle Lösungen durch 0,22-μm-Filter. Lösungen zwei Wochen lang bei 4 °C lagern oder für die Langzeitlagerung bei -20 °C einfrieren.
- Berechnung von Potentialen für flüssige Übergänge und Erstellung von Aufzeichnungsprotokollen.
HINWEIS: Eine Änderung der extrazellulären Chloridkonzentration nach der Etablierung der Ganzzellkonfiguration führt zu einem signifikanten Liquid Junction Potential (LJP), das korrigiert werden muss. LJPs können direkt gemessen oder berechnet werden, hier kommt die letztere Option zum Einsatz. In diesem Protokoll wird eine Online-Korrektur verwendet, die ein Aufzeichnungsprotokoll für jeden externen Puffer erfordert. Für eine größere Anzahl externer Lösungen wird jedoch eine Nachkorrektur von LJP empfohlen, um Fehlkorrekturen zu vermeiden.
- Öffnen Sie den Junction Potential Calculator (JPC) und öffnen Sie das Dialogfeld "Neues Experiment". Wählen Sie dann "Patch-Clamp-Messungen". Wählen Sie "Ganzzellenmessungen" und "Standard-Salzlösungselektrode" und geben Sie eine Temperatur von 25 °C ein. Fahren Sie zwischen den einzelnen Schritten fort, indem Sie die Auswahl durch Drücken der Schaltfläche "Weiter" übernehmen.
HINWEIS: Die Versuche werden bei einer Raumtemperatur von 25 °C in einem klimatisierten Labor durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Pufferlösungen Raumtemperatur haben, bevor Sie mit den Experimenten beginnen. Um die Probentemperatur zu variieren, kann eine Inkubationsstufe oder -kammer verwendet werden. Die Badtemperatur kann häufig mit einem Thermometer gemessen werden.
- Es werden alle einzelnen Anionen- und Kationenkonzentrationen der pipettierten Lösung und des Puffers mit hohem Chloridgehalt gemäß den in Tabelle 1.
aufgeführten Konzentrationen addiert.
Anmerkung: Der JPC berechnet für die Startbedingungen einen LJP von -0,5 mV.
- Klicken Sie auf "Neue Badlösung", um die anionische und kationische Zusammensetzung des chloridarmen Puffers einzugeben.
Anmerkung: Das JPC wird nun einen neuen LJP von +12,6 mV entsprechend der geänderten extrazellulären Aufzeichnungslösung berechnen.
- Bereiten Sie zwei LJP-korrigierte Protokolle für die beiden Messbedingungen vor, indem Sie das berechnete LJP vom angewendeten Haltepotential subtrahieren; -0,5 mV für die hohen und +12,6 mV für die externen Lösungen mit niedrigem Chloridgehalt. So beginnen die Protokolle mit -79,5 mV (hohes Chlorid) bzw. -92,6 mV (niedriges Chlorid), um in beiden Fällen ein LJP-korrigiertes Starthaltepotential von -80 mV zu erhalten.
Anmerkung: Die folgenden Schritte gelten für die in der Materialliste erwähnte Datenerfassungssoftware.
- Öffnen Sie den Protokolleditor in der Erfassungssoftware. Wählen Sie im Menü "Modus" die Option "Episodische Stimulation" und fügen Sie 7 Sweeps hinzu.
- Wechseln Sie in das Menü "Wellenform" im Editor und fügen Sie eine Periode von 200 ms mit 0 mV Haltepotenzial hinzu, gefolgt von einer 2 s Periode mit unterschiedlichem Haltepotenzial ab -79,5 mV für hohes Chlorid. Fügen Sie für die zweite Periode einen "Delta-Pegel" von 20 mV hinzu, um das Haltepotenzial bei jedem Sweep um 20 mV zu erhöhen.
- Wenden Sie innerhalb der Spannungsschritte des Wellenform-Editors eine Beleuchtungsperiode von 500 ms mit 540 nm Licht (3,10 mW/mm²) an. Um dies zu tun, ändern Sie das "digitale Bitmuster" des angeschlossenen Shutters, das die Lichtquelle steuert, so, dass es 500 ms nach der oben beschriebenen zweiten Periode aktiv ist (siehe 1.2.6).
Anmerkung: Die Lichtintensität kann biophysikalische Eigenschaften von Kanalströmen wie Amplitude oder Inaktivierung beeinflussen. Daher sollten Lichtleistungsdichten immer angegeben werden. Um die Lichtleistung nach dem Passieren aller Optiken und des Deckglases zu messen, verwenden Sie ein kalibriertes Optometer. Um die Leistungsdichte zu berechnen, bestimmen Sie das Leuchtfeld des Objektivs mit einem Objektmikrometer und dividieren Sie die gemessene Lichtleistung durch das ermittelte Leuchtfeld.
- Speichern Sie das Protokoll für die extrazelluläre Lösung mit hohem Chloridgehalt. Ändern Sie das Protokoll und ersetzen Sie das Haltepotenzial der ersten Stufe durch -92,6 mV (niedriger externer Chloridgehalt). Speichern Sie dieses zweite Protokoll, um den extrazellulären Zustand mit niedrigem Chloridgehalt zu messen.
- Lysin-Beschichtung von Glasdeckgläsern nach angepasstem Protokoll.
- Legen Sie mehrere 100 Deckgläser in eine Petrischale aus Glas und fügen Sie 250 mL HCl (1 N) hinzu.
- Stellen Sie die Petrischale mit den Deckgläsern auf einen linearen Schüttler. Schütteln Sie 72 Stunden lang bei 120 U/min, um die Deckgläser zu reinigen, und spülen Sie sie anschließend mit Reinstwasser ab, um den pH-Wert zu neutralisieren.
- Weichen Sie diese zur weiteren Reinigung in einer kleinen Menge 95%igem Ethanol ein.
HINWEIS: Saubere Deckgläser können in 70% Ethanol gelagert werden, bevor Sie fortfahren. Arbeiten Sie für die folgenden Schritte unter einer Laminar-Flow-Haube.
- Mit einem Bunsenbrenner und einer Pinzette jedes Deckglas abflammen und in eine neue Petrischale umfüllen.
- Inkubieren Sie die Glasdeckgläser mit einer sterilen 50 μg/mL Poly-D-Lysin-Lösung für mindestens 1 h (oder über Nacht) bei Raumtemperatur, während Sie mit einem linearen Shaker bei 150 U/min schütteln.
- Waschen Sie die Deckgläser mit Reinstwasser, um überschüssiges Poly-D-Lysin zu entfernen.
- Breiten Sie die Deckgläser 10 Minuten lang zum Trocknen auf sterilem Papier aus und setzen Sie sie zur Sterilisation (mindestens 20 Minuten) UV-Licht (ultraviolettem Licht) aus.
- Sammeln Sie die Deckgläser in einer sterilen Petrischale, die mit Alufolie bedeckt ist, bis sie verwendet werden.
- Bereiten Sie die DNA des Ps ACR1-Gensvor, das mit mCherry fusioniert ist, unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken.
- Klonieren Sie die humane Codon-optimierte Gensequenz, die für PsACR1 kodiert, in ein peGFP-C1-Plasmid (CMV (Cytomegalovirus)-Promotor, Kanamycin-Resistenz) im Rahmen mit dem mCherry-Fluorophor unter Verwendung von Restriktionsenzymen oder anderen etablierten Klonierungsmethoden.
Hinweis: Es können auch andere Fluorophore verwendet werden, aber stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Filtersets zur Verfügung haben, um ihre Fluoreszenz unter dem Mikroskop im Aufbau zu beobachten.
- Transformieren Sie die Plasmid-DNA mittels Hitzeschock gemäß dem Standardprotokoll in chemokompetente XL1Blue E. coli-Zellen und plattieren Sie sie auf Agarplatten (30 μg/ml Kanamycin). Züchten Sie die plattierten Bakterien über Nacht bei 37 °C.
- Am nächsten Tag werden 4 mL Lysogenese-Bouillonmedium, ergänzt mit 30 μg/mL Kanamycin, mit Zellen aus Einzelkolonien inokuliert und über Nacht bei 37 °C und 180 U/min in einem Inkubator inkubiert.
- Nach der Inkubation über Nacht reinigen Sie die Plasmid-DNA aus den Kulturen mit einem im Handel erhältlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Aussaat der Zellen
HINWEIS: Führen Sie die Schritte unter einer Laminar-Flow-Haube aus.
- Legen Sie bis zu drei lysinbeschichtete Glasdeckgläser nebeneinander in eine 35-mm-Petrischale.
Anmerkung: Drücken Sie sie vorsichtig gegen den Boden der Schüssel, damit sie nicht aufeinander rutschen.
- Saatgut: 1,5 x 105 HEK-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) in 2 ml Standard-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in jeder Schale.
- Ergänzen Sie all-trans Retinal in einer Endkonzentration von 1 μM. Züchten Sie die Zellen mindestens einen Tag lang, bevor Sie mit Schritt 1.6 fortfahren.
- Transfizieren Sie die Zellen transient per Lipofektion.
- Für jede Zellschale wird eine Lösung aus 2 μg Plasmid-DNA (Desoxyribonukleinsäure) in 250 μl DMEM ohne FBS und 6 μl Transfektionsreagenz hergestellt.
- Nach 15 Minuten Inkubation die Lösung vorsichtig (tropfenweise) in die Zellen geben.
- Agarbrücken vorbereiten
- 0,75 g Agarose zu 50 mL steriler Natriumchloridlösung (140 mM) geben und durch Erhitzen in der Mikrowelle auflösen.
HINWEIS: 2 - 3 M KCl für die Vorbereitung der Agarbrücke reduziert LJP aufgrund der höheren Konzentration (z. B. konstante Diffusion von der Brücke) und der gleichen Beweglichkeit von K+- und Cl-Ionen weiter, wurde jedoch vermieden, um das Austreten von Ionen (insbesondere Cl-) in die Badlösung zu minimieren.
- Füllen Sie 10 μl Pipettenspitzen (oder einen Schlauch mit kleinem Durchmesser) mit der flüssigen Agaroselösung mit einer Spritze.
Anmerkung: Vermeiden Sie Luftblasen in der Brücke.
- Nachdem die Agarbrücken abgekühlt und erstarrt sind, lagern Sie sie in einer sterilen 140 mM Natriumchloridlösung.
- Bereiten Sie die Aufnahme- und Badelektroden vor.
- Entfernen Sie die Silberdrähte aus dem Bad und der Aufnahmeelektrode des Patch-Clamp-Setups.
- Polieren Sie die Drähte mit Schleifpapier, um Silberchlorid aus früheren Experimenten zu entfernen. Tauchen Sie den sauberen Silberdraht in 3 M KCl und verbinden Sie ihn mit dem Pluspol einer 1,5 V Batterie für die elektrolytische Beschichtung mit Silberchlorid.
HINWEIS: Anstelle einer Batterie kann ein Labornetzteil verwendet werden.
- Ziehen Sie Patch-Pipetten mit niedrigem Widerstand (1,5-3,0 MΩ) mit einem Mikropipettenabzieher aus Glaskapillaren und polieren Sie sie. Bewahren Sie die Pipetten für den Tag der Messung staubfrei auf.
- Schalten Sie alle Setup-Komponenten ein, um sie 30 Minuten vor den Aufnahmen auf Arbeitstemperatur aufzuheizen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer Raumtemperatur haben.
>2. Messungen der Selektivität
- Starten Sie die Aufzeichnungen 24 bis 48 h nach der transienten Transfektion der Zellen.
- Legen Sie ein Deckglas in die Messkammer und verschließen Sie es mit Silikon, um ein Auslaufen des externen Puffers zu verhindern. Bewahren Sie die Petrischale mit den anderen Deckgläsern in einem Brutkasten für die nächsten Experimente auf.
- Füllen Sie die Kammer vorsichtig mit extrazellulärem Puffer (hoch [Cl-]), um eine Zellablösung zu verhindern, legen Sie ihn dann unter das Mikroskop und verwenden Sie das 40X-Objektiv, um Zellen sichtbar zu machen.
- Legen Sie eine Agarbrücke über die Badelektrode und setzen Sie diese zusammen mit dem Füllstandssensor und dem Perfusionsauslass des Badhandlers in die Kammer ein.
- Tauschen Sie die extrazelluläre Lösung zweimal durch 1 ml frische externe Lösung (hoch [Cl-]) aus, um das restliche Kulturmedium und abgelöste Zellen zu entfernen.
- Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie nach einer transfizierten (fluoreszierenden) Zelle, die von anderen Zellen isoliert werden muss. Verwenden Sie einen Triple-Band-Filtersatz und orangefarbenes Licht (590 nm; Bandbreite 15 nm; 100 % Intensität), um mCherry anzuregen und zu visualisieren.
Anmerkung: HEK-Zellen können durch Gap Junctions elektrisch mit ihren Nachbarn gekoppelt werden, was zu einem geringen Membranwiderstand in der Ganzzellkonfiguration führt.
- Füllen Sie eine der gezogenen Pipetten mit intrazellulärer Lösung und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Pipette mehrmals wenden.
- Montieren Sie die Pipette auf dem Pipettenhalter und üben Sie einen positiven Druck aus, um ein Verstopfen der Spitze zu verhindern.
- Lokalisieren Sie die Spitze der Patch-Pipette unter dem Mikroskop und navigieren Sie sie mit dem Mikromanipulator nahe an die Zelle.
Anmerkung: Die folgenden Schritte gelten für die in der Materialliste erwähnte Verstärker-, Datenerfassungs- und Auswertesoftware.
- Starten Sie den "Membrantest" in der Datenerfassungssoftware und legen Sie einen Spannungsschritt (Prüfimpuls; z.B. 5 mV für 10 ms, Basislinie bei 0 mV), manuell oder automatisch über eine angegebene Software im "Bad-Modus" während des Ausführens von "Membrantest" in der Datenerfassungssoftware.
- Prüfen Sie, ob sich der Pipettenwiderstand im gewünschten Bereich (1,5-3,0 MΩ) befindet.
- Null-Offset-Ströme durch Einstellen des Pipettenpotentials durch Drehen des Pipetten-Offset-Knopfes am Verstärker während der Arbeit im "Bad-Modus" des "Membrantests".
- Richten Sie einen Patch in der Ganzzellenkonfiguration ein.
HINWEIS: Die folgenden Schritte erfordern das Anlegen von Über- und Unterdruck, der an den seitlichen Anschluss des verwendeten Pipettenhalters abgegeben wird. Dies kann entweder mit einer Spritze, über ein Mundstück oder einen elektronisch gesteuerten Druckregler erfolgen. Bei diesem Protokoll wird über ein Mundstück Über- und Unterdruck angelegt.
- Nähern Sie sich der Zelle langsam mit der Patch-Pipette von oben und lassen Sie den Überdruck unmittelbar vor der Berührung los.
HINWEIS: Wenn sich die Spitze in der Nähe der Zelle befindet, steigt der Widerstand leicht an; Dies wird durch eine verkleinerte Größe des Prüfimpulses angezeigt.
- Ändern Sie den "Membrantest" vom "Bad-Modus" in den "Patch-Modus", um das Haltepotenzial auf das erwartete Ruhepotenzial der Zellen (-30 bis -40 mV) zu bringen.
- In einigen Fällen bildet sich die zellgebundene Konfiguration nach dem Ablassen des Überdrucks von selbst. Wenn nicht, üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, um die Gigaseal-Bildung zu unterstützen.
Anmerkung: Die zellgebundene Konfiguration wird hergestellt, wenn der Prüfimpuls auf zwei kleine kapazitive Spitzen am Anfang und Ende des Impulses reduziert wird und der Membranwiderstand im GΩ-Bereich liegt. Negative Spannungen bis zu -60 mV können die Bildung von Gigasealen erleichtern.
- Kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie die Knöpfe für die "Pipettenkapazitätskompensation" drehen, um eine flache Reaktion des Testimpulses zu erhalten.
- Brechen Sie das Pflaster, ohne die Dichtung zu zerstören, indem Sie kurze Impulse von Unter- oder Unterdruck mit zunehmender Stärke anwenden, um eine Ganzzellkonformation zu erhalten.
Anmerkung: Ein erfolgreicher Übergang von der zellgebundenen zur Ganzzellkonfiguration wird durch eine Zunahme der kapazitiven Peaks angezeigt.
- Wenden Sie eine Serienwiderstandskompensation an, indem Sie die Ganzzellenparameter und Kompensationseinstellungen des verwendeten Verstärkers einstellen, um das Membranpotential genau auf die gewünschte Haltespannung zu klemmen.
- Schalten Sie den "Membrantest" in den "Ganzzellen"-Modus, schalten Sie im Bedienfeld "Serienwiderstandskompensation" "Vorhersage" und "Korrektur" bis zu 90% ein, um Überschüsse und Oszillationen des kapazitiven Ansprechverhaltens zu vermeiden, schalten Sie den Schalter für die Ganzzellenkompensation ein und stellen Sie die Ganzzellenparameter mit den entsprechenden Knöpfen auf der Vorderseite ("Ganzzellenkapazität" und "Serienwiderstand") des Verstärkers iterativ ein, um eine ideale Reaktion der flachen Testdichtung.
Anmerkung: Eine detaillierte Beschreibung der Serienwiderstandskompensation und -korrektur finden Sie im Handbuch oder in der Richtlinie des Verstärkers, da dieses Verfahren je nach Hersteller unterschiedlich ist.
- Warten Sie nach dem Einrichten der Ganzzellkonfiguration mindestens 2 Minuten, bevor Sie aufzeichnen, um sicherzustellen, dass die intrazelluläre Lösung ausreichend durch die Patch-Pipette ersetzt wird.
- Erfassen Sie lichtinduzierte Ströme bei unterschiedlichen Haltepotentialen mit den Protokollen, die zuvor (in 1.2) eingerichtet wurden.
- Den extrazellulären Puffer in der Kammer mindestens fünfmal auf niedriges [Cl-] austauschen, ohne das Pflaster zu zerstören, und ein anderes Strom-Spannungs-Verhältnis (vgl. Schritt 1.2) bei der neuen Chloridkonzentration aufzeichnen.
Anmerkung: Ein Perfusionssystem für den automatisierten Puffertausch erleichtert diesen Prozess, ist aber nicht notwendig.
- Wiederholen Sie 2.15. für jeden zu prüfenden ionischen Zustand, aber überprüfen Sie zwischen den Messungen wiederholt die Qualität des Pflasters durch einen oben beschriebenen "Membrantest".
Anmerkung: Um eine genaue Membranspannung und eine stabile intrazelluläre Ionenzusammensetzung zu gewährleisten, sollte der Membranwiderstand über 500 MΩ liegen, während der Zugangswiderstand 10 MΩ nicht überschreiten sollte (siehe 2.12.6). Vergessen Sie nicht, die Ganzzellparameterkompensation für den Membrantest auszuschalten.
- Wiederholen Sie den 2.2. bis 2.15. für mehrere Zellen, aber nehmen Sie für jede Testreihe ein neues Deckblatt, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten.
Tabelle 1: Ionenzusammensetzung der gepufferten Lösungen. Zusammensetzung von intrazellulären (intra.) und extrazellulären (extra.) Puffern für Chloridselektivitätsexperimente in HEK-Zellen. Verwendete Abkürzungen: Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES) und Aspartat (ASP). Alle Konzentrationen sind in mM angegeben.
kg
kg
kg
| intra. | zusätzlich.1 | zusätzlich.2 |
| hohes Chlorid | Niedriger Chloridgehalt | Niedriger Chloridgehalt |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | Nr. 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | arabische Ziffer | arabische Ziffer | arabische Ziffer |
| MgCl2 | arabische Ziffer | arabische Ziffer | arabische Ziffer |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA (EGTA) | 10 | 0 | 0 |
| Ph | 7,2 | 7,2 | 7,2 |
| Osmolarität | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |