Perforierte Patch-Clamp-Aufnahmen von sensorischen Neuronenzellkörpern des Innenohrs

Zusammenfassung

Quelle: Iyer, M. R., et al. Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglion Somata von neugeborenen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen. J. Vis. Exp. (2023).

Dieses Video demonstriert die Patch-Clamp-Technik zur Messung von Ionenströmen in sensorischen Neuronenzellkörpern des Innenohrs. Darin wird die Herstellung und Verwendung einer polierten Patch-Clamp-Pipette beschrieben, die mit einer internen Lösung gefüllt ist, die Amphotericin B enthält und die Membran perforiert, um die Bewegung der Ionen zu ermöglichen und gleichzeitig die intrazellulären Bedingungen zu erhalten. Spannungsimpulse werden angelegt, um die Aktivität der Ionenkanäle auszulösen und aufzuzeichnen und Einblicke in deren Eigenschaften und Verhalten zu erhalten.

Protokoll

>1. Aufnahme

HINWEIS: Bei diesem Verfahren werden Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom isolierten Ganglion typischerweise 12-24 Stunden nach der Beschichtung durchgeführt. Andere Labore haben über Ergebnisse von Neuronen nach viel längeren Zeiträumen in Kultur berichtet.

1. Bereiten Sie die Aufnahmekammer vor
   1. Verwenden Sie die Schnellwechsel-Aufnahmekammer (oder eine gleichwertige Kammer), die Patch-Clamp-Aufnahmen direkt in der Kulturschale ermöglicht. Stellen Sie die Kammer auf das inverse Mikroskop ein.
   2. Setzen Sie die Kulturschalen mit Glasboden in die Kammer ein.
   3. Führen Sie die L-15-Lösung durch ein Perfusionsschlauchsystem in die Aufnahmekammer ein. Stabilisieren Sie den Perfusions-Ein- und -Ausfluss in der Kammer mit einer Geschwindigkeit von 0,5-1 ml pro Minute.
2. Bereiten Sie die interne Lösung für die Ladeelektroden vor
   1. Tauen Sie ein Aliquot der internen Lösung mit perforiertem Pflaster auf. Geben Sie 2,5 ml der Lösung auf eine 35-mm-Kulturschale. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Kulturschale und beschriften Sie ihn mit "Tip Dip". Stellen Sie sie in einer staubfreien Zone beiseite, da es sehr wichtig ist, diese Lösung so sauber wie möglich zu halten.
   2. Wiegen Sie 1 mg Amphotericin-B und fügen Sie 20 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Die Lösung verdrehen und herunterschleudern, bis sich das gesamte Amphotericin-B in der Lösung befindet. Geben Sie 10 μl der DMSO/Amphotericin-B-Lösung zu den restlichen 2 ml der aufgetauten perforierten Pflaster-Lösung. Ziehen Sie die Lösung mit einer Pipette zwei- bis dreimal heraus und zerstreuen Sie sie, um sicherzustellen, dass sich das DMSO/Amphotericin-B gleichmäßig mit der internen Lösung vermischt hat. Die Lösung hat einen leichten gelblichen Schimmer.
   3. Ziehen Sie die perforierte Pflasterlösung von Amphotericin-B in eine 3-ml-Spritze. Geben Sie eine 34-G-Spitze in die Spritze. Wickeln Sie die Spritze in Alufolie ein und halten Sie die Spritze auf Eis.
      Anmerkung: Diese Lösung muss alle 2 Stunden neu hergestellt werden, um die Wirksamkeit des Amphotericin-B bei der Perforation der Zellmembran zu gewährleisten. Amphotericin-B ist lichtempfindlich und muss mit Aluminiumfolie oder anderen Methoden gegen Licht abgeschirmt werden.
3. Patch-Clamp-Aufnahmen
   1. Visualisieren Sie die Neuronen mit einem 10x- oder 20x-Objektiv. Passen Sie die Beleuchtung an und optimieren Sie die Optik, um die Grenzen und Schatten um die Zelle herum zu sehen.
   2. Überprüfen Sie die Qualität der isolierten Neuronen. Versuchen Sie es nur mit Neuronen mit glatten und ebenen Oberflächen, die nicht zu stark kontrastiert sind und nur kleine, verteilte Krater aufweisen. Achten Sie auch darauf, Neuronenpaare, Neuronen, die von Trümmern umgeben sind, oder andere Zellen zu vermeiden.
   3. Identifizieren Sie bei 100-facher Vergrößerung ein Neuron oder ein Feld von Neuronen, die geflickt werden sollen, und richten Sie sie in der Mitte des Sichtfelds aus.
   4. Füllen Sie die Spitze der Pipette mit einer sauberen Lösung, die kein Amphotericin enthält, indem Sie die Spitze (für ~20 s) in die saubere Lösung tauchen, die in eine Kulturschale gegeben wurde. Durch die Kapillarwirkung wird eine kleine Menge Lösung in die Spitze gezogen.
      Anmerkung: Führen Sie diesen Schritt unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop durch, mit dem Sie bestimmen können, wie gut die Spitze die Tip-Dip-Lösung hält. Wenn die Lösung nicht für ~10-20 s hält, ist die Form der Elektrode nicht ideal. Konfigurieren Sie in diesem Fall das Elektrodenziehprogramm neu, um eine längere Spitze zu erzeugen.
   5. Füllen Sie dann die Rückseite der Pipette mit der internen Lösung, die Amphotericin enthält. Das Filament in der Pipette zieht die Lösung nach unten, um auf die saubere Lösung in der Spitze zu treffen. Lassen Sie das Filament die Lösung sanft nach unten ziehen und versuchen Sie nicht, Blasen herauszuklopfen, da dies das Amphotericin zu schnell an die Spitze drückt.
   6. Verwenden Sie eine Spritze, um die Lösung herauszuziehen, die sich ganz hinten an der Elektrode befinden kann.
      Anmerkung: Es ist sehr wichtig, von diesem Punkt aus schnell zu arbeiten und eine hochohmige Dichtung auf der gewünschten Zelle zu bilden.
   7. Führen Sie die Pipette in den Pipettenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass die Pipette fest in der Halterung sitzt, um ein Abdriften der Pipette zu verhindern. Wenn die Pipette nicht stabil ist, tauschen Sie die Dichtungs-O-Ringe an der Vorder- und Rückseite des Pipettenhalters aus, um die Abdrift zu minimieren und eine starke Saugleistung zu gewährleisten. Ersetzen Sie die Pipette durch eine frisch befüllte.
   8. Senken Sie die Pipette in das Bad der Aufnahmekammer.
   9. Platzieren Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Sichtfelds. Stellen Sie sicher, dass die Spitze frei von Luftblasen oder anderen Ablagerungen ist.
   10. Legen Sie im Membrantest einen Spannungsschritt (5 mV) an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Überwachen Sie den Eingangswiderstand während des gesamten Prozesses der Bildung einer Dichtung auf der Zelle.
   11. Heben Sie das Pipetten-Offset-Potential auf, so dass der Pipettenstrom im Membrantestmodus von pClamp Null anzeigt.
   12. Korrigieren Sie die Pipettenkapazität mit der Funktion zur schnellen Kapazitätskompensation am Patch-Clamp-Verstärker (Cp-Schnellregler im Multiclamp Commander-Softpanel).
   13. Bewegen Sie die Pipette nach unten in die Zelle.
   14. Sobald die Pipette nahe genug am Neuron ist, wechseln Sie zum Objektiv mit höherer Vergrößerung und senden Sie das Bild durch eine Kamera an einen Monitor (verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, insgesamt 400-fache Vergrößerung). Passen Sie die Pipette an und zentrieren Sie das Neuron neu.
   15. Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode in die Nähe des Somas. Lokalisieren Sie die Mitte des Neurons auf dem Monitor und positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode über dem Neuron.
   16. Nähern Sie sich dem Neuron von oben, so dass die Elektrode in der Mitte der kugelförmigen Zelle landet. Stellen Sie den Pipettenversatz so ein, dass die konstanten Gleichstrompotentiale im System auf Null gesetzt werden.
   17. Positionieren Sie die Pipette nahe an der Membran. Landen Sie fest in der Mitte der Zelle.
       Anmerkung: Bei der Landung kommt es zu einer kleinen Vertiefung auf der Oberfläche des Neurons und einer Verdoppelung/Verdreifachung des Eingangswiderstands.
   18. Üben Sie Unterdruck (Absaugung) mit einer Spritze oder Mundpipette aus. Schalten Sie das Haltepotenzial von -60 mV ein. Der Dichtungswiderstand sollte sich erhöhen, bis er einen Giga-Ohm passiert.
       Anmerkung: Arbeiten Sie schnell, um die Zeit zwischen dem Befüllen einer Elektrode und der Landung auf einer Zelle zu verkürzen. Es vergeht eine begrenzte Zeit, bevor das Amphotericin, das der perforierten Pflasterlösung zugesetzt wird, die Elektrodenspitze erreicht. Sobald die Spitze mit Amphotericin verunreinigt ist, ist es schwierig, hochohmige Dichtungen zu bilden, und der Widerstand erreicht oft ein Plateau von ~200 Megaohm.
   19. Sobald sich eine Giga-Ohm-Dichtung bildet, lassen Sie den Unterdruck ab. Sobald sich die Dichtung bildet, wenden Sie eine schnelle Kapazitätskompensation an, um die Amplitude der Kapazitätstransienten der Pipette im Membrantestmodus so weit wie möglich zu reduzieren.
   20. Wenn Amphotericin zu wirken beginnt, beobachten Sie, wie der Eingangswiderstand langsam abnimmt und der Strom, der als Reaktion auf den Spannungsschritt von 5 mV fließt, allmählich zunimmt, wenn das Amphotericin in die Membran eintritt. Eine plötzliche Abnahme des Serienwiderstands anstelle einer allmählichen Stabilisierung deutet darauf hin, dass es zu einer spontanen Ruptur gekommen ist.
   21. Schätzen Sie die Gesamtzellenkapazität und den Serienwiderstand mit der kapazitiven transienten Nulling-Funktion des Verstärkers. Dokumentieren und überwachen Sie den Serienwiderstand zu Beginn und regelmäßig während des Experiments.
       Anmerkung: Die Stabilisierung des Serienwiderstands kann zwischen 5 und 20 Minuten dauern, abhängig von der Größe der Elektrode und der Menge an sauberer Lösung, die in die Pipette gezogen wird. Die Modi Voltage-Clamp und Current-Clamp können verwendet werden, sobald sich der Serienwiderstand unter 30 Megaohm stabilisiert hat. Ein Anschwellen oder Schrumpfen der Neuronen während der Aufzeichnung wird manchmal beobachtet, aber selten, wenn die Osmolarität und der pH-Wert der Lösungen korrekt eingestellt sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amphotericin	Sigma-Aldrich	Nr. A4888-100MG	Für perforierte Patch-Aufnahmen.
ATP-Dinatrium	Sigma-Aldrich	Nr. A7699	Additiv zur internen Lösung
CaCl2	J.T. Bäcker	Nr. 1311-01	Additiv zur internen Lösung
Dmso	Biotium	90082
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E0396	Additiv zur internen Lösung
Elektroden-Abzieher	Narashige	PC-10
Ethanol	Dekon-Labore	Nr. 2716	zum Reinigen des Kopfes und um die Sezierbank herum
Filamentierte Borosilikat-Kapillaren für Elektroden	Sutter Instrumente	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	zur pH-Pufferung aller Lösungen im Protokoll
Heizplatte / Magnetrührer	VWR	Tel.: 76549-914
K2SO4, Kaliumsulfat	Sigma Aldrich	P9458-250G	Additiv zur internen Lösung
Kcl	Sigma-Aldrich	Nr. 93333	Additiv zur internen Lösung
KOH (1 M)	Honeywell	Artikel-Nr.: 319376-500ML	Um die innere Lösung auf den gewünschten pH-Wert zu bringen.
Aufzeichnungskammer mit flachem Bad für Kulturschalen	Warner Instruments	Tel.: 64-0236
MgCl2-hexahydrat	Sigma-Aldrich	M1028	Additiv zur internen Lösung
microFil Nadel zum Befüllen von Mikropipetten - 34 Gauge	Welt Präzisionsinstrumente	MF34G
Mikroschmiede	Narashige	MF-90	Zum Polieren von Elektroden.
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S7653	Additiv zur internen Lösung
NaOH (1 m)	Thomas Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 319511-500ML	für Titration pH
Sauerstoff, medizinische Qualität, mit angemessenem Regler und Schlauch	USC Materialwirtschaft	MEDOX200 (Kennung: 00015)	zum Auflösen in Sezier- und Badlösungen
Poly-D-Lysin-beschichtetes Glasboden Kulturschale	Mattek	P35GC-0-10-C	Neuronen für die Kultur zu plattieren
PES-Membranfilter, 0,2 Mikrometer	Nalgene	Tel.: 566-0020	für Filterlösungen
PES-Membran sterile Spritzenvorsatzfilter, 0,22 μm, 30 mm	CELLTREAT	229747	zum Filtern von Lösungen, die in Spritzen aufgezogen werden
pH-Messgerät	Mettler Toledo	Modell S20
Zelle "Referenz"	Welt Präzisionsinstrumente	RC1T
Wissenschaftliche Skala	Mettler Toledo	XS64
Messkolben, 1000 Milliliter
Wasser, sterile Röhre, R>18,18 MegaOhm cm (z.B. gefiltert durch ein Millipore-Sigma Wasseraufbereitungssystem)	Millipore-Sigma	CDUFBI001