Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Elektrodenvorbereitung (Abbildung 1A-C)
HINWEIS: Computer-Pin-Loci ist einfach ein Zackenkontakt als Teil der Signalschnittstelle in Kommunikationsgeräten. Es besteht aus einem Stecker, der in die Buchse eingesteckt wird.
- Trennen Sie die Stifte und Buchsen vorsichtig mit Hilfe einer Zange von den Pin-Loci des Computers (Abbildung 1A). Verbinden Sie die Stifte und Buchsen zu einer Elektrode und tragen Sie Cyanacrylat auf, um eine starke Klebeverbindung herzustellen (Abbildung 1C).
- Legen Sie die Elektroden in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Becherglas und legen Sie es für 10 Minuten in den Ultraschallreiniger. Stellen Sie sie für 30 Minuten in einen Trockenschrank bei 45 °C. Sterilisieren Sie die Elektroden 30 Minuten lang mit ultraviolettem (UV) Licht.
>2. Chirurgischer Eingriff (Abbildung 1D-F)
- Bereiten Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente und stereotaktischen Apparate vor. Betäuben Sie das neugeborene Rattenbaby mit Isofluran-Anästhesie (2,5 %) mit Luft. Wenn der Welpe tief anästhesiert ist, passen Sie die Dosis von Isofluran auf 1,0% an. Führen Sie vor der Operation eine Schwanz- oder Zehenkneifung durch, um die richtige Narkosetiefe zu gewährleisten.
- Fixieren Sie den Kopf des Welpen in der stereotaktischen Apparatur, indem Sie die Ohrbügel in die Gehörgänge stecken und leicht festziehen.
Anmerkung: Ziehen Sie die Ohrbügel nicht zu fest an, da der Schädel des Neugeborenen sehr weich ist.
- Halten Sie das sterile Operationsfeld aufrecht, indem Sie alle Geräte mit 70 % Ethanol besprühen. Machen Sie mit einem Skalpell einen 15 mm großen Schnitt am Kopf. Ziehen Sie die Kopfhaut mit einer Pinzette an den vier Ecken vorsichtig von der Mittellinie weg. Legen Sie etwas in Kochsalzlösung getränkte Watte unter die Haut, um den Schnitt weit offen zu halten (Abbildung 1D).
- Finde die Bregma- und Lambda-Punkte auf dem Schädel und markiere sie mit einem Bleistift. Mit einer Spritzennadel (26 G) zwei Bohrlöcher in den präfrontalen Kortex (PFC) und den Hippocampus bohren.
Anmerkung: Der PFC befindet sich +1,8 mm posterior des Bregmas und -0,5 mm lateral der Mittellinie, während der Hippocampus -2,0 mm vor dem Bregma und ±0,5 mm lateral der Mittellinie liegt (Abbildung 1D und E). Die Tiefe der Elektrode sollte nicht mehr als 2 mm unter der kortikalen Oberfläche liegen, um Hirnschäden zu minimieren.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Elektroden zu halten, und führen Sie die Referenz- und Aufzeichnungselektroden in den PFC bzw. den Hippocampus ein. Tragen Sie Erythromycin-Salbe um die Elektrode auf, um eine mögliche Infektion zu vermeiden. Fixieren Sie die Elektrode mit Cyanacrylat.
- Bereiten Sie dentalen Acrylzement so vor, dass er eine klebrige und viskose Konsistenz hat. Tragen Sie den Zahnzement auf, um die Elektroden und den Rest des Schädels zu bedecken.
Anmerkung: Trocknen Sie den Schädel gründlich ab, bevor Sie den Zahnzement auftragen.
- Tragen Sie 5% Pikrinsäure auf die Elektroden auf, um sie zu schützen.
Anmerkung: Der gesamte Eingriff sollte in einer Biosicherheitshaube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und injizieren Sie 300 μl 10 % Glukose subkutan. Lege es zur Erholung auf eine Heizdecke. Stellen Sie sicher, dass das Tier warm (37 °C) und gehfähig (d. h. vollständig genesen) ist. Verabreichen Sie Buprenorphin intraperitoneal (0,05 mg/kg) bei postoperativen Schmerzen.
Anmerkung: Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat (d. h. normales Verhalten und Bewegungen).
- Bringen Sie den Welpen mit seiner Mutter in seinen Heimatkäfig zurück, nachdem er das Bewusstsein wiedererlangt hat. Warten Sie zwei Tage, bis sich das Tier vollständig erholt hat.
>3. EEG-Aufzeichnung
- Verbinden Sie nach vollständiger Genesung die am Schädel des Welpen implantierten Elektroden mit dem Verstärker in seinem eigenen Käfig. Schließen Sie den Verstärker an einen Analog-Digital-Wandler an und schließen Sie den Wandler an einen Computer an. Die Verbindungsleinen sollten vorsichtig behandelt werden, damit sie sich nicht verheddern.
- Wählen Sie für die Aufzeichnung mindestens 10.000 Hz Abtastrate an der Datenerfassungseinheit (die Bandbreite des Senders beträgt 1-100 Hz). Stellen Sie sicher, dass die Daten ordnungsgemäß abgetastet werden.
- Nach der Ausgangsaufzeichnung injizieren Sie dem Welpen intraperitoneal Kainsäure (KA, 2 mg/kg), um epileptische Anfälle auszulösen. 15 Minuten nach der KA-Injektion beobachten und protokollieren Sie die epileptischen Entladungen. Die durch KA hervorgerufenen Anfälle sind in der Regel physisch.
HINWEIS: Die iktal-tonische Dauer beträgt ca. 15,2 ±0,9 s, die Anfallsdauer ca. 62±5 s. Krampfanfälle können bei der neugeborenen Ratte durch IP-Injektion von Chloralhydrat (400 mg/kg) verhindert werden.
- Speichern Sie die digitalisierten Daten und analysieren Sie sie mit Signalverarbeitungssoftwarepaketen wie spike2. Zeigen Sie den Leistungspegel verschiedener Frequenzkomponenten im EEG-Signal von Neugeborenen auf, indem Sie eine Leistungsspektrumanalyse durchführen. Berechnen Sie die Leistung in einem Zeitrahmen von 1 Minute, indem Sie die mittlere quadratische Amplitude von 1 bis 100 Hz (EEG-Band) ermitteln.
