Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung und Biocytin-Füllung
Abhängig von der Art der synaptischen Verbindung werden drei verschiedene Ansätze verwendet, um synaptisch gekoppelte Neuronen zu finden. Wenn die Verbindungswahrscheinlichkeit gering ist (was bei den meisten erregenden Verbindungen zu erwarten ist), gehen Sie wie folgt vor:
- Neuronale Verbindungen mit geringer Konnektivität
- Füllen Sie die Patch-Pipetten mit einer internen Lösung der in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzung. Für alle Aufzeichnungen in der Ganzzellkonfiguration ist Biocytin in Konzentrationen zwischen 3 - 5 mg/ml in die interne Lösung (Pipette) zu geben, um gute Färbeergebnisse für die prä- und postsynaptischen Neuronen zu erzielen. Lassen Sie Biocytin mindestens 15 - 30 min in die Zelle diffundieren (abhängig von der Größe des Neurons).
HINWEIS: Fügen Sie der Lösung, die in den unten genannten "Suchpipetten" verwendet wird, kein Biocytin hinzu.
- Patchen Sie ein mutmaßliches postsynaptisches Neuron im Ganzzellmodus. Verwenden Sie Patch-Pipetten mit einem langen und schlanken Schaft. Dies erleichtert die Manövrierfähigkeit der Pipette unter dem Objektiv und reduziert Bewegungsartefakte, die beim Einbringen der Elektrode in die Scheibe auftreten können.
- Patchen Sie dann ein potenzielles präsynaptisches Neuron in einer zellgebundenen Konfiguration mit einer "suchenden" Patch-Pipette mit einem Widerstand von 8 - 10 MΩ und einem kleinen Spitzendurchmesser. Diese Pipetten bilden ein "loses" zellgebundenes Pflaster. Füllen Sie die "suchende" Pipette mit einer internen Lösung, in der K+ durch Na+ ersetzt wird (Tabelle 2), um zu verhindern, dass Neuronen bei der Suche nach einer präsynaptischen Zelle depolarisieren.
HINWEIS: Der "lockere" Dichtungswiderstand liegt nicht im GΩ-Bereich, sondern typischerweise bei 30 - 300 MΩ.
- Halten Sie das Membranpotential unter der "losen" Dichtung auf etwa -30 bis -60 mV im Stromzangenmodus. Legen Sie dann große Stromimpulse (0,2 - 2 nA) an, um ein Aktionspotential in der potentiellen präsynaptischen Zelle hervorzurufen. Beobachten Sie dieses Aktionspotential als kleines Ährchen auf dem Spannungsgang.
- Stellen Sie die Stimulationsfrequenz auf 0,1 Hz ein, um einen Abfluss einer postsynaptischen Reaktion zu verhindern. Verwenden Sie niedrigere Stimulationsfrequenzen, wenn das Hirngewebe sehr unreif ist oder die synaptische Verbindung nicht sehr zuverlässig ist.
- Falls das "postsynaptische" Neuron nicht auf die Stimulation des getesteten "präsynaptischen" Neurons reagiert, flicken Sie ein neues Neuron im "lockeren" Dichtungsmodus. Ersetzen Sie die "suchende" Patch-Elektrode nicht, solange die Dichtung mit einem Widerstand von >30 MΩ hergestellt ist. Auf diese Weise können bis zu 30 potenziell präsynaptische Neuronen getestet werden.
Anmerkung: Um eine Beschädigung des Neurons während des Suchvorgangs mit einer losen Patch-Klemme zu vermeiden, sollte die suchende Pipette im Vergleich zur Ganzzell-Patch-Pipette nur sanft abgesaugt werden.
- Wenn die Stimulation im "lockeren" Siegelmodus zu einem EPSP/IPSP (exzitatorisches postsynaptisches Potential/inhibitorisches postsynaptisches Potential) mit einer Latenz von <5 ms im postsynaptischen Neuron führt, entfernen Sie die "suchende" Pipette aus dem präsynaptischen Neuron.
- Ersetzen Sie die "suchende" Patch-Pipette durch eine Patch-Elektrode, die mit biocytinhaltiger, regulärer interner Lösung gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass diese Aufnahmepatch-Pipette einen Widerstand von 4 - 8 MΩ hat. Je größer die SOMA-Größe, desto geringer kann der Elektrodenwiderstand sein.
- Patchen Sie das präsynaptische Neuron und zeichnen Sie es im Ganzzell-Stromklemmenmodus auf. Auslösen von Aktionspotentialen durch Strominjektion in die präsynaptischen Neuronen und Aufzeichnen der postsynaptischen Antwort. Speichern Sie die Daten auf einem Computer für eine spätere Offline-Analyse.
Tabelle 1. Pipettenlösung mit niedrigem Chloridgehalt.
kg
kg
kg
kg
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kg
kg
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kg
kg
kg
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| Mm | g/L | g/50 ml |
| K-Gluconat | Nr. 135 | 31.622 | 1,5811 |
| Kcl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Phosphokreatin | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Passen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,3 an |
| Osmolarität ~300 mOsmol/L |
| Fügen Sie 3 - 5 mg/ml Biocytin hinzu |
Tabelle 2. Pipettenlösung mit hohem Na-Gehalt für die Suche nach synaptisch gekoppelten Neuronen.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Mm | g/L | g/50 ml |
| Na-Gluconat | Nr. 105 | 22,92 | 1.146 |
| NaCl | 30 | 1,76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Phosphokreatin | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| pH-Wert auf 7,3 mit NaOH einstellen |
| Osmolarität ~300 mOsmol/L |
