Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Patch Clamp Aufnahmen
- Legen Sie die Elektrodenlösung (siehe Tabelle 1) auf Eis, um eine Degradation zu verhindern. Füllen Sie die Glaspflasterpipette mit filtrierter intrazellulärer Lösung (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 μm) und setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter des Kopftisches ein. Üben Sie durch eine 5-ml-Spritze einen sanften, positiven Druck auf die Pipette aus, indem Sie den Kolben um etwa 1 ml verschieben, bevor Sie die Pipette in die Badlösung absenken.
Hinweis: Dadurch wird verhindert, dass die Pipette verstopft.
- Wählen Sie den Modus "V-Clamp", indem Sie den Modusknopf am Verstärker drehen, und öffnen Sie dann die Benutzeroberfläche "Membrantest" in der Software. Bewegen Sie die Pipette unter dem Mikroskop nahe an das Zielneuron.
Anmerkung: In der intakten DRG-Präparation umhüllt eine dünne Schicht aus Satelliten-Gliazellen jedes Neuron.
- Verwenden Sie den positiven Druck der Pipette, um die Schicht der Satelliten-Gliazellen zu durchqueren, bis eine plötzliche Vergrößerung des Raums zwischen dem Neuron und der umgebenden Schicht der Satelliten-Gliazellen beobachtet wird. Bewegen Sie die Pipette weiter in Richtung des Neurons, bis ein "Grübchen" am Neuron beobachtet wird.
Anmerkung: Im Vergleich zu Aufzeichnungen von dissoziierten Neuronen muss der Überdruck etwas größer sein, was dazu beiträgt, die Schicht der Satelliten-Gliazellen zu durchdringen und die Chancen auf ein erfolgreiches Patchen zu erhöhen.
- Reduzieren Sie den Überdruck. Als nächstes erzielen Sie eine Giga-Ohm-Dichtung mit sanftem Absaugen.
Anmerkung: Bei dieser Methode liegt die Erfolgsquote bei der Aufzeichnung bei mindestens 70 %.
- Rufen Sie die Konfiguration für die Ganzzellenaufzeichnung wie zuvor beschrieben ab.
- Eindringen Sie durch einen kurzen, aber starken Sog kurz in die Zellmembran der Neuronen. Alternativ können Sie die "Zap"-Funktion des Verstärkers verwenden, während der Sog angelegt ist.
- Sobald ein Ganzzellenmodus eingerichtet ist, kompensieren Sie die Ganzzellenkapazität und den Serienwiderstand (Rs), indem Sie die Kapazitäts- und Widerstandskompensationsknöpfe am Verstärker drehen.
Anmerkung: Rs beträgt normalerweise 5-20 MΩ.
- Verlassen Sie die Zelle, wenn Rs anfänglich größer als 30 MΩ ist oder sich während der Aufzeichnung um mehr als 20 % ändert. Messen Sie auch das Ruhemembranpotential; Verlassen Sie eine Zelle, wenn sie mehr als -50 mV beträgt.
- Schließen Sie das Fenster "Membrantest". Wählen Sie den Modus "I-clamp normal", indem Sie den Modusknopf am Verstärker drehen.
- Klicken Sie in der Software auf "Protokoll öffnen", wählen Sie das Protokoll zur Messung von Rheobase aus und laden Sie es. Klicken Sie auf "Aufnehmen", um die Aufnahme zu starten. Messen Sie den Eingangswiderstand und die Rheobase, um die neuronale Erregbarkeit zu untersuchen, indem Sie eine abgestufte Reihe von depolarisierenden Strömen in Schritten von 100 pA injizieren.
- Klicken Sie in der Software auf "Protokoll öffnen", wählen Sie das Protokoll zur Messung von Rheobase aus und laden Sie es. Klicken Sie auf "Aufnehmen", um die Aufnahme zu starten. Messen Sie den Eingangswiderstand und die Rheobase, um die neuronale Erregbarkeit zu untersuchen, indem Sie eine abgestufte Reihe von depolarisierenden Strömen in Schritten von 100 pA injizieren.
- Verwenden Sie eine Datenerfassungs- und Analysesoftware (z. B. Clampfit), um die aufgezeichneten Spuren gemäß den Anweisungen des Herstellers zu analysieren. Die Software berechnet den Eingangswiderstand (Rin) basierend auf dem stationären I-U-Verhältnis während der abgegebenen Hyperpolarisationsströme. Bewegen Sie den Cursor, um den Wert für den Rheobase- und Membranschwellenwert zu messen. Anmerkung: Die Amplitude des Stroms, der zur Induktion des AP erforderlich ist, wird als Rheobase definiert, und die niedrigste Spannung zur Induktion von AP ist als Membranschwelle definiert.
- Zeichnen Sie die durch den Liganden induzierten Ströme auf.
- Füllen Sie eine Pipette mit den spezifischen Agonisten.
Hinweis: Im vorliegenden Bericht haben wir 100 μM Glutamat und 100 μM AITC verwendet, um die Ströme zu induzieren, die durch Glutamatrezeptoren bzw. TRPA1-Rezeptoren vermittelt werden.
- Überprüfen Sie die Pipette, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Inneren befinden. Setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter ein. Verbinden Sie den Pipettenhalter mit einem Schlauch, der an ein Medikamentenabgabesystem angeschlossen ist.
- Verwenden Sie den Manipulator, um die Pipette innerhalb von 50 μm um das Neuron zu bewegen. Stellen Sie den Druck des Medikamentenausgabesystems auf 1 psi und die Dauer auf 1 Sekunde ein. Schalten Sie den Aufnahmemodus auf Spannungsklemme und klemmen Sie bei -70 mV. Üben Sie kurz den Druck über das Medikamentenausgabesystem aus, um einen medikamenteninduzierten Strom aufzuzeichnen.
Tabelle 1
kg
kg
kg
kg
| 100 ml intrazelluläre Lösung |
| Konzentration (mM) | Bestandteil | Mw | g |
| Nr. 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | Kcl | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 | EGTA (EGTA) | | |
| arabische Ziffer | MgCl2*6H2O | 203,3 | |
| Anmerkungen: Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit KOH und die Osmolarität auf 260 - 280 mOsm mit Saccharose und destilliertem Wasser ein. 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2GTP zugeben und vor sofortiger Verwendung filtrieren. |
