Evaluierung von Bandsynapsen in bestimmten Frequenzbereichen der Maus-Cochlea

Zusammenfassung

Quelle: Yu, S., et al. Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen in spezifischen Frequenzregionen der Maus-Cochlea. J. Vis. exp. (2019).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung von Bandsynapsen in bestimmten Regionen der Cochlea der Maus. Es verwendet Immunfärbung und konfokale Bildgebungsverfahren, um funktionelle Synapsen über verschiedene Frequenzbereiche in jeder Cochlea-Windung zu identifizieren.

Protokoll

Alle Verfahren, die den Umgang mit Tieren beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Auswahl von Tieren

1. Verwenden Sie für alle Experimente adulte männliche C57BL/6J-Mäuse (8 Wochen alt) als Tiermodell.
   HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse, die eine Spleißvariante des Cdh23 tragen, zeigen eine beschleunigte Seneszenz im auditorischen System, die sich in einem Verlust von 40 % der Bandsynapsen an der basalen Drehung der Cochlea und einem Verlust von 10 % an der mittleren Drehung im Alter von 6 Monaten widerspiegelt, gefolgt von einem raschen Anstieg dieses Verlustes in der gesamten Cochlea mit zunehmendem Alter. Daher raten wir zur Vorsicht bei der Verwendung von C57BL/6J-Mäusen, die älter als 6 Monate sind, für die auditive Forschung. Andere Stämme von Mäusen können je nach spezifischen experimentellen Zielen verwendet werden.
2. Untersuchen Sie die Mäuse mit einem professionellen diagnostischen Taschenotoskop, um Erkrankungen des Außen- oder Mittelohrs auszuschließen, bevor Sie das Gehör beurteilen. Mögliche Anzeichen können Flüssigkeit oder Eiter im äußeren Gehörgang, Rötungen und Schwellungen im lokalen Gewebe sowie eine Perforation des Trommelfells sein.
   HINWEIS: Obwohl dies selten vorkommt, sollten Mäuse mit Außen- oder Mittelohrerkrankungen ausgeschlossen werden, sobald sie identifiziert sind.

>2. Bewertung des Hörvermögens

1. Anästhesieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg) und Xylazinhydrochlorid (10 mg/kg). Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie anhand von schmerzhaften Reizen (z. B. Zehenkneifreflex).
   HINWEIS: Wenn der Zehenkneifreflex vollständig fehlt, hat das Tier eine ausreichende Anästhesietiefe für den Hörtest erreicht. Wenn mehr Zeit für bilaterale ABR-Aufzeichnungen (auditorische Hirnstammreaktion) benötigt wird, verabreichen Sie eine niedrigere Dosis (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) von Anästhetika, um die ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. Achten Sie darauf, eine Überdosierung von Anästhetika zu vermeiden, da dies bei Mäusen zum Tod führen kann.
2. Halten Sie die Körpertemperatur des anästhesierten Tieres mit einem thermoregulierenden Heizkissen auf 37,5 °C. Stellen Sie das narkotisierte Tier in einen elektrisch und akustisch abgeschirmten Raum, um Störungen während des gesamten Hörtests zu vermeiden.
   HINWEIS: Halten Sie die physiologische Temperatur während des gesamten Eingriffs aufrecht, bis das Tier vollständig wach ist, um den Tod durch Unterkühlung nach der Anästhesie zu verhindern.
Die
3. subdermalen Nadelelektroden (20 mm, 28 G) werden am Scheitel des Schädels (Aufzeichnungselektrode), im ipsilateralen Ohrspeicheldrüsenbereich unterhalb der Ohrmuschel (Referenzelektrode) bzw. im kontralateralen Ohrspeicheldrüsenbereich (Masseelektrode) mit einer Tiefe von 3 mm unter der Haut des Mauskopfes platziert.
4. Verwenden Sie einen Closed-Field-Lautsprecher, um die akustische Stimulation über ein 2 cm langes Kunststoffrohr mit kegelförmiger Spitze durchzuführen. Setzen Sie die Spitze in den äußeren Gehörgang ein.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die elektrische Impedanz in den Aufzeichnungs- und Referenzelektroden weniger als 3 kOhm (normalerweise 1 kOhm) beträgt. Wenn die Impedanz hoch ist, ändern Sie die Einführstelle der Elektrode, reinigen Sie die Elektrode mit Alkohol oder ersetzen Sie die Elektrode, um Änderungen der ABR-Wellenamplitude zu vermeiden.
5. Erzeugen Sie für die ABR-Aufnahme Ton-Pips (3 ms Dauer, 1 ms Anstiegs-/Abfallzeiten, mit einer Rate von 21,1/s, Frequenz: 4–48 kHz) und präsentieren Sie sie mit abnehmenden Schalldruckpegeln (SPLs) von 90 bis 10 dB in 5-10 dB SPL-Schritten. In diesem Schritt werden die Antworten verstärkt (10.000 mal), gefiltert (0,1–3 kHz) und gemittelt (1.024 Samples/Stimulus-Pegel).
   HINWEIS: ABRs werden für jeden Stimulus-Pegel in 10-dB-Schritten erfasst, wobei weitere 5 dB-Schritte in der Nähe des Schwellenwerts liegen.
6. Bestimmen Sie bei jeder Frequenz den ABR-Schwellenwert, der sich auf den minimalen Schalldruckpegel bezieht, was zu einer zuverlässigen ABR-Aufzeichnung mit einer oder mehreren unterscheidbaren Wellen führt, die durch visuelle Inspektion eindeutig identifiziert werden können.
   HINWEIS: In der Regel ist es notwendig, den Vorgang für niedrige Schalldruckpegel um den Schwellenwert herum zu wiederholen, um die Konsistenz der Wellenformen zu gewährleisten. Die Ansprechschwelle ist der niedrigste Stimuluspegel, bei dem die Wellenform beobachtet werden kann, wenn eine Abnahme um 5 dB zum Verschwinden der Wellenform führen würde.

>3. Verarbeitung von Cochlea-Gewebe

1. Nach der ABR-Aufzeichnung werden die anästhesierten Mäuse über eine Zervixluxation eingeschläfert, geköpft, die Bulla von der ventralen Seite freigelegt und mit einer scharfen Schere geöffnet, um Zugang zur Cochlea zu erhalten.
2. Entfernen Sie mit einer feinen Zange das Schläfenbein, durchtrennen Sie die Steigbügelarterie, entfernen Sie den Steigbügel aus dem ovalen Fenster und reißen Sie die runde Fenstermembran auf. Stechen Sie ein kleines Loch an der Spitze der Cochlea, indem Sie die Spitze einer Nadel vorsichtig drehen (13 mm, 27 G).
3. Fixieren Sie die isolierten Knochen mit 4 % (wt/vol) Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) über Nacht bei 4 °C. Spülen Sie das Fixiermittel mit einer feinen Pipette vorsichtig durch die perilymphatischen Räume, indem Sie es auf die ovalen oder runden Fenster (als Einlass) und die Öffnung an der Spitze (als Auslass) auftragen.
   HINWEIS: Einige Proteine erfordern eine kurze Fixierungsdauer, um eine Zerstörung ihrer Epitope für die Immunmarkierung zu vermeiden. In solchen Fällen sind die Knochen in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für 2 h zu inkubieren, abhängig von den Anweisungen des Herstellers für die Immunhistochemie. Die Fixation kann auch über eine Herzperfusion durchgeführt werden, um das Cochlea-Blut zu entfernen, wodurch Hintergrundgeräusche aufgrund unspezifischer Färbungen in späteren Stadien vermieden werden, insbesondere in Mausmodellen der Cochlea-Synaptopathie.
4. Spülen Sie die Knochen dreimal für 5 Minuten mit 0,1 M kaltem PBS, um restliches Paraformaldehyd zu entfernen. Entkalken Sie die Knochen mit 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) entweder bei RT für 4 h oder bei 4 °C für 24 h durch sanftes Schütteln in einem horizontalen Shaker bei 20 U/min. EDTA kann auf halbem Weg aufgefrischt werden.
   HINWEIS: Die Entkalkungszeiten hängen von der EDTA-Konzentration und den Präferenzen der Benutzer ab. Entkalktes Gewebe sollte ein gewisses Maß an Zähigkeit beibehalten, was die Manipulation von isolierenden Cochlea-Ganzkörpern in späteren Schritten erleichtert. Schläfenknochen können in 10 % EDTA mit Rotation entkalkt werden, so dass die Forscher das Labor nach ABR-Tests und Fixationsexperimenten verlassen können. Die Entkalkungszeit ist flexibel im Bereich von 20 bis 30 h bei 4 °C.
5. Übertragen Sie ein entkalktes Schläfenbein von EDTA auf 0,1 M PBS. Verwenden Sie die Dumont-Pinzette #3 und #5 und die 27 G-Nadel, um nacheinander die apikale, mittlere und basale Cochlea-Region zu präparieren und dann die Cochlea unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop aus dem Knochen zu präparieren. Machen Sie mit einer Rasierklinge eine Reihe kleiner Schnitte entlang des Spiralbandes und entfernen Sie die Tektorialmembran und die Reissner-Membran (Abbildung 1).
   HINWEIS: Solange die präparierte Cochlea intakt ist, kann dieser Vorgang gemäß dem üblichen Protokoll des jeweiligen Bedieners geändert werden.
6. Präparieren Sie das verbleibende auditorische Epithel einschließlich des spiralförmigen Limbus weiter in einzelne Cochlea-Windungen (Spitze, Mitte und Basis mit Hakenregion) für die Präparation des gesamten Präparations.
7. Messen Sie unter einem 40-fach-Ölobjektiv eines Lichtmikroskops die Länge der Basilarmembran mit einer im Okular platzierten 250-μm-Skala, die entlang der Stereozilien der IHCs eingestellt werden kann.
8. Berechnen Sie die Länge jeder Cochlea-Windung, indem Sie alle Segmentlängen (250 μm pro Segment) addieren, und erhalten Sie gleichzeitig die Gesamtlänge der Basilarmembran, indem Sie die Längen jeder Windung addieren.
9. Rechnen Sie die Gesamtlänge der Basilarmembran einschließlich der Hakenregion in einen Prozentsatz um, der auf dem Abstand von der Cochlea-Spitze basiert (0 % bezieht sich auf die Cochlea-Spitze, 100 % auf die Cochlea-Basis).
10. Rechnen Sie diesen Abstand mit einer logarithmischen Funktion (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f) mit einer Steigung von 1,25 mm/Oktave der Frequenz in die Cochlea-Kennfrequenz um, wobei d der normierte Abstand vom Cochlea-Scheitelpunkt in Prozent und f die Frequenz in kHz ist), wie zuvor beschrieben. Auf diese Weise kann der Frequenzbereich in einem entsprechenden Bereich der Basilarmembran an jeder Cochlea-Windung erfasst werden.

>4. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Nach der Dissektion wird jede Cochlea-Windung in ein separates 2,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und die Cochlea-Windungen in 10 % Ziegenserum/PBS/0,1 % Triton X-100 für 1 h bei RT auf einem Rotator inkubiert.
2. Entfernen Sie die obige Blockierungs-/Permeabilisierungslösung aus jedem Röhrchen mit einer 200-μl-Pipettenspitze unter einem Dissektionsmikroskop und inkubieren Sie die Proben mit Primärantikörpern, die über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator in 5 % Ziegenserum/PBS/0,1 % Triton X-100 verdünnt wurden.
   HINWEIS: Für die Immunmarkierung von cochleären synaptischen Bändern verwenden Sie den präsynaptischen Marker Maus Anti-Carboxyl-terminales Bindungsprotein 2 IgG1 (CtBP2, markiert die B-Domäne des RIBEYE-Gerüstproteins, 1:400) und den postsynaptischen Marker Maus Anti-Glutamatrezeptor 2 IgG2a (GluR2, markiert eine Untereinheit der α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure oder AMPA-Rezeptor, 1:200).
3. Dreimal für 5 min mit 0,1 M kaltem PBS spülen, um verbleibende Primärantikörper zu entfernen, und die Proben mit Sekundärantikörpern inkubieren, verdünnt in 5 % Ziegenserum/PBS/0,1 % Triton X-100 bei RT für 2 bis 20123 Stunden im Dunkeln auf einem Rotator.
   HINWEIS: Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörpermischungen mit Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) und Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500) gegen Ziegenmaus vor, die zu den in Schritt 4.2 verwendeten Primärantikörpern komplementär sind. Um die Markierungseffizienz für synaptische Bänder zu verbessern, empfehlen wir die Auswahl spezifischer Sekundärantikörper. Einige Labore verlängern die Inkubation mit Sekundärantikörpern, um die GluR2-Immunmarkierung zu erhöhen.
4. Spülen Sie dreimal für 5 Minuten mit 0,1 M PBS, um verbleibende Sekundärantikörper zu entfernen, und übertragen Sie die Proben aus 2,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf 35-mm-Platten mit 0,1 M PBS.
5. Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) auf den Objektträger und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Eindeckmedium. Legen Sie eine Kante eines Deckglases auf die Folie und lassen Sie sie los, um das Deckglas sanft fallen zu lassen.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Haarzellen nach oben zeigen und dass es während des Eingriffs nicht zu Falten oder Verdrehungen der Cochlea-Proben kommt, montieren Sie die Cochlea-Proben unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop
.
6. Legen Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C in eine Objektträgerbox, um sie trocknen zu lassen, und nehmen Sie sie dann unter einem konfokalen Lasermikroskop auf.

>5. Morphologische Bewertung von Cochlea-Bandsynapsen

1. Bildträger mit einem konfokalen Mikroskop mit drei Lasern – einer 405-nm-UV-Diode, einem 488-nm-Argon-Laser und einem 561-nm-diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS) zur Anregung von DAPI (Anregungsspektrum 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (Anregungsspektrum 496–549 nm) und Alexa Fluor 568 (Anregungsspektrum 573–631 nm), beziehungsweise.
2. Erfassen Sie konfokale Z-Stapel über einen Abstand von 8 μm von jeder Cochlea-Windung mit einer hochauflösenden 63-fachen Ölimmersionslinse.
   HINWEIS: Nach der Definition sollten alle Parameter für die Digitalisierung von Mikrofotografien gespeichert und einheitlich auf alle Objektträger angewendet werden.
3. Für die synaptische Punktzahl stellen Sie die Z-Stacks (Schrittweite von 0,3 μm) so ein, dass sie sich über die gesamte Länge der inneren Haarzellen (IHCs) erstrecken, um sicherzustellen, dass alle synaptischen Punktzahlen abgebildet werden können.
4. Führen Sie die Bilder, die Punktzahlen enthalten, in einem Z-Stapel zusammen, um die Z-Achsen-Projektion zu erhalten, und importieren Sie sie in die Bildverarbeitungssoftware.
5. Dividieren Sie die synaptische Gesamtzählung in jedem Z-Stapel in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der IHCs (entspricht den manuellen DAPI-Kernzählungen), um die Anzahl der synaptischen Punkte für jeden IHC zu berechnen. In jedem spezifischen Frequenzbereich wird der Durchschnitt aller synaptischen Punkte in drei Bildern verschiedener mikroskopischer Felder mit 9–11 IHCs berechnet.
   1. Skizzieren Sie den Interessenbereich (ROIs), einschließlich der basolateralen Bereiche jedes IHC, mithilfe der Freihandauswahltaste. Verwenden Sie die Messfunktion für die automatische Quantifizierung von Puncta und die Wassereinzugsgebietsfunktion, um zwischen eng benachbarten Stellen zu unterscheiden.
   2. Führen Sie nach jeder automatisierten Zählung visuelle Inspektionen mit manuellen Korrekturen durch, um sicherzustellen, dass die Punktzählung zuverlässig ist.
      HINWEIS: Die Experimentatoren sollten sich darüber im Klaren sein, ob der Objektträger von der Spitze, der mittleren oder der basalen Drehung der Cochlea stammt.
6. Beurteilen Sie die synaptische Struktur und Verteilung visuell, um einzelne IHCs manuell von ihren Nachbarn mit dem Pencil Tool (M) zu isolieren und so die Zytoskelettarchitektur und die synaptische Lokalisierung besser zu visualisieren.
7. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern (CtBP2) und postsynaptischen Rezeptorfeldern (GluR2) zu untersuchen, extrahieren Sie den Voxelraum um das Band herum mit dem rechteckigen Auswahlrahmen-Werkzeug und isolieren Sie das einzelne Band durch Zuschneiden. Durch Klicken auf Bild > Bildgröße erhalten Sie ein Miniaturbild dieser Miniaturprojektionen, das dann zur Identifizierung von gepaarten Synapsen (erschienen als eng nebeneinander liegende Paare von CtBP2-positiven und GluR2-positiven Punkten) im Vergleich zu verwaisten Bändern (ohne postsynaptische Glutamatrezeptor-Patches) verwendet werden kann (Abbildung 2).
   HINWEIS: Normale Cochlea-Synapsen erscheinen als kombinierte Immunmarkierung des präsynaptischen Bandes innerhalb der Haarzelle (Anti-CtBP2) und des postsynaptischen Glutamatrezeptorpflasters auf der auditorischen Nervenendigung (Anti-GluR2). Einige Labore verwenden konfokale Projektionen in Verbindung mit 3D-Modellierung, um die Größe oder das Volumen des synaptischen Pflasters zu quantifizieren. Vor einem signifikanten Verlust von Bandsynapsen sind Bänder, die Größenänderungen oder ohne gepaarte Glutamatrezeptor-Patches aufweisen, wahrscheinlich ein Hinweis auf eine synaptische Dysfunktion.

Ergebnisse

Abbildung 1: Lokalisation der Cochlea-Frequenz bei Mäusen. (A) Ein repräsentatives Bild der vollständig explantierten Cochlea, die unter einem Stereodissektionsmikroskop aus dem Schläfenbein präpariert wurde. (B) Die Cochlea der Maus ist in apikale, mittlere und basale Windungen unterteilt, wobei die Cochlea-Seitenwand entfernt wird. Rote Kreise a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ketaminhydrochlorid	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Xylazinhydrochlorid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	X-1251	10 mg/kg
TDT-Physiologie-Apparat	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditorisches Physiologie-System III
SigGen/BioSig Software	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditorisches Physiologie-System III
Heizkissen	Spaß für Haustiere	11072931136
Dumont Pinzette 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Dumont Pinzette 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereo-Dissektionsmikroskop	Nikon Corp., Tokio, Japan	SMZ1270
Ziegenserum	ZSGB-BIO, Peking, China	ZLI-9021
Anti-Glutamat-Rezeptor 2, extrazellulär, Klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	MAB397	Maus
Aufgereinigte Maus Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	Maus
Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus-IgG1-Antikörper	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Nr. A21124	Ziege
Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG2a-Antikörper	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Nr. A21131	Ziege
Einhängemedium mit DAPI	ZSGB-BIO, Peking, China	ZLI-9557
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	TCS SP8 II
Image Pro Plus Software	Medienkybernetik, Bethesda, MD, USA	Version 6.0
Professionelles Diagnose-Taschen-Otoskop	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai, China	HS-OT10
Nadel-Elektrode	Freundschaft Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, China	Nr. 1029	20 mm, 28 g
Closed-Field-Lautsprecher	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	CF1