Bewertung der Interaktionen zwischen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen in einer Co-Kultur

Zusammenfassung

Quelle: Fuchs, Q. et. al., Co-Kultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidischen Geräten zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Bewertung der neuronalen elektrischen Aktivität in einer Co-Kultur von hiPSC-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen und Gliomzellen unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts mit Multielektrodenarrays.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Protokoll der Kokultur

1. Passen Sie den Aussaattag und die Konzentration für UW479- und BT35-Zelllinien so an, dass 80 % der konfluenten Zellen erreicht werden, wenn die Co-Kultur beginnen sollte, was einer Kulturdauer von 21 Tagen für glutamaterge Neuronen entspricht.
2. Trypsinisieren Sie UW479- und BT35-Zellen und säen Sie sie auf die glutamatergen Neuronen in jedem speziellen mikrofluidischen Gerät (mit einer Zieldichte von 900 Zellen/^mm2 für jeden Zelltyp), bevor Sie die pädiatrischen hochgradigen Gliome (pHGG)-Zellen in das mikrofluidische Gerät mit gereiften glutamatergen Neuronen säen.
3. Die Co-Kulturen werden 2 Tage lang in einer kontrollierten Umgebung (37 °C, 5 % CO₂) mit dem glutamatergen Neuron Day11 und dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium aufbewahrt.
4. Zählen Sie pHGG-Zellen anhand der mikroskopischen Bilder, die mit einer Bildanalysesoftware analysiert wurden, um ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die folgende Formel: 100 - ((Anzahl der Zellen bei D23 / Anzahl der Zellen bei D21) x 100).

>2. Elektrophysiologische Aufzeichnung

1. Führen Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung mit einem kommerziellen System und kommerziell erhältlicher Software durch.
   Anmerkung: Die Experimente wurden mit einem Multielektrodenarray (MEA) durchgeführt, das aus Elektroden mit einem Durchmesser von 30 μm und einem Abstand von 100 μm bestand.
2. Durchführung einer ersten elektrophysiologischen Aufzeichnung an glutamatergen Neuronen an D21 vor der Aussaat von pHGG-Zellen. Nutzen Sie die differenzierten glutamatergen Neuronen als Kontrolle und kultivieren Sie sie allein parallel zur Co-Kultur. Führen Sie eine zweite Aufzeichnung für beide Bedingungen durch, wie im nächsten Schritt mit der Nummer 3 beschrieben.
3. Führen Sie eine zweite elektrophysiologische Aufzeichnung bei D23 durch (nach 2 Tagen Co-Kultur).

Tabelle 1: Zusammensetzung von Kulturmedien für hiPS-abgeleitete glutamaterge Neuronen.

Komponenten	Sämedium	D4 mittel	D7 mittel	D11 und weiter mittel
DMEM/F-12 Mittel	0,5-fach	0,25-fach	0,125-mal	Ø
Neurobasales Medium	0,5-fach	0,25-fach	0,125-mal	Ø
BrainPhys Medium	Ø	0,5-fach	0,75-mal	1x
SM1 Nachtrag	1x	1x	1x	1x
N2 Ergänzung-A	1x	1x	1x	1x
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM
BDNF	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml
GDNF	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml	10 ng/ml
TGF-β1	1 ng/ml	1 ng/ml	1 ng/ml	1 ng/ml
Geltrex	30 μg/ml	Ø	Ø	Ø
Ergänzung zur Aussaat	1x	Ø	Ø	Ø
Tag 4 Zuschlag	Ø	1x	Ø	Ø

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
256MEA100/30iR-ITO-ohne	mcs	256MEA100/30iR-ITO-ohne
40 μm Sonde für Zepterzähler	Dutscher	Artikel-Nr.: 53750
60 μm Sonde für Zepterzähler	Dutscher	Nr. 51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	Sigma	Nr. G8541
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II	Thermo Scientific	HERASafe Typ KS12
Kortikale glutamaterge Neuronen	BrainXell	BX-0300
DMEM/F12 Mittel	Sigma	Nr. D8437
DPBS 1X	Dutscher	Nr. L0615-500
EasYFlaskTM Zellkulturflaschen 75cm3	Nunc	156499
Fötales Rinderserum (FBS)	Dutscher	500105
GDNF	Peprotech	Nr. 450-10
Geltrex	Lebenstechnologien	A1413201
Menschliches BDNF	Peprotech	Nr. 450-02
Brutkasten	Memmert	IC0150med
MEA2100	mcs	Artikel-Nr.: 181205-MEA2100-11240
Mikropipette P10	Schneidermuskel	LH-729020
Mikropipette P100	Schneidermuskel	LH-729050
Mikropipette P1000	Schneidermuskel	LH-729070
Mikropipette P200	Schneidermuskel	LH-729060
Mikroröhrchen Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	Artikel-Nr.: 33290
Multichannel-Experimentator	mcs	-
N2 Ergänzung-A	Stammzellen	7152
Neurobasales Medium	Lebenstechnologien	21103049
Neurocult SM1 neuronales Nahrungsergänzungsmittel	Stammzellen	Nr. 5711
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) ohne L-Glutamin	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid EP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipette für Zellkultur 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipette für Zellkultur 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Plaque chauffante (CultureTemp)	Belart	370151000
Poly-D-Lysin	Sigma	Nr. P6407
Primovert Mikroskop	Zeiss	Artikel-Nr.: 415510-1100-000

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