Implantation eines Elektrodenarrays und einer optischen Faser in den Hippocampus der Maus

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung von optischen Fasern (Abbildung 1A)

1. Verwendung von Multimode-Glasfasern (105 μm Kern, glasummantelt mit Quarzkern, 0,22 NA). Lösen Sie die 125 μm dicke Ummantelung des Faserkerns mit einem Mikroabisolierer ab, während die Faser noch an der Faserspule befestigt ist.
2. Schneiden Sie die Faser mit einem Diamantmesser auf eine Länge von ca. 2-3 cm ab.
3. Führen Sie die Faser in eine Zirkonoxid-Keramik-Stabzwinge (ID: 126 μm) ein. Etwa 0,5-1 mm der optischen Faser sollten aus der konvexen Seite der Ferrule herausragen.
4. Tragen Sie mit einer Nadel einen Tropfen Epoxidkleber auf beide Enden der Zwinge auf, jedoch nicht auf die Seiten der Zwinge. Alternativ kannst du auch Sekundenkleber verwenden.
5. Lassen Sie den Kleber mindestens 30 Minuten trocknen.
6. Polieren Sie die konvexe Seite der Ferrule mit einer Diamant-Läppfaser-Polierfolie (3 μm Körnung).
7. Testen Sie die Genauigkeit der Lichtübertragung mit einem optischen Leistungsmesser.
   1. Stellen Sie die Wellenlänge am Leistungsmesser auf die gleiche Wellenlänge wie der verwendete Laser ein.
   2. Positionieren Sie das Patchkabel so, dass die Spitze zur Mitte des Sensors zeigt. Schalten Sie den Laser ein und lesen Sie die Lichtleistung vom Leistungsmesser ab. Notieren Sie sich den Wert.
   3. Verbinden Sie die optische Faser über eine Gegenhülse mit dem Patchkabel und positionieren Sie sie mit der Spitze der Faser zur Mitte des Sensors. Schalten Sie den Laser ein und lesen Sie die Lichtleistung vom Leistungsmesser ab. Notieren Sie sich den Wert.
   4. Berechnen Sie die Übertragungsrate, indem Sie den zweiten Wert durch den ersten Wert dividieren. Wenn die Übertragungsrate unter 0,5 liegt, entsorgen Sie die Faser. Andernfalls verwenden Sie es für die Implantation.
   5. Testen Sie die Übertragungsrate für jede Faser vor der Implantation.
   6. Passen Sie für spätere Experimente die Lichtintensität des Lasers an die Übertragungsrate der optischen Faser an: Stellen Sie die Lichtleistung der Patchkabelspitze auf 5-15 geteilt durch die Übertragungsrate ein, um eine endgültige Lichtleistung von 5-15 mW von der Faserspitze zu erreichen.

>2. Vorbereitung von Wolframdraht-Arrays für LFP-Aufnahmen (Abbildung 1B)

1. Kleben Sie mehrere (z.B. 6) 100 μm Silica-Röhrenführungen parallel auf die klebrige Seite eines Stücks Klebeband. Schneiden Sie ein Stück, ca. 4-6 mm, für eine Drahtarray-Montage ab.
2. Formvar-isolierte 45 μm Wolframdrähte mit einer Pinzette durch die Führungsrohre fädeln.
3. Sechs lackisolierte Kupfer-Feinbonddrähte (ca. 5 mm lang) und einen Erdungsdraht (ca. 2-3 cm lang) abisolieren, indem Sie die Isolierung an beiden Enden mit einem Skalpell abkratzen. Löten Sie sie an die Nanoconnector-Pins.
4. Verbinden Sie jeden Bonddraht mit jeweils einem Tropfen leitfähiger Silberfarbe mit einem Wolframdraht. Mindestens 30 min trocknen lassen.
5. Tragen Sie eine minimale Menge Zement auf, um die Drähte zu bedecken. Tragen Sie keinen Zement auf die Wolframdrähte auf, die in das Hirngewebe eingeführt werden, oder auf den oberen Teil des Nanosteckers. Lassen Sie den Zement mindestens 30 Minuten trocknen.
6. Führen Sie einen Winkelschnitt (5-20°) der Wolframdrähte mit einer stumpfen Edelstahlschere durch, um eine zuverlässige Implantation von Drähten unterhalb oder oberhalb der ventral angrenzenden Zone neben dem Stratum pyramidale zu ermöglichen, wo die Theta-Amplitude zu gering ist, um die Entrainment-Genauigkeit abzuschätzen.
7. Isolieren Sie die Spitze (ca. 2 mm) des Erdungskabels, indem Sie die Isolierung mit einem Skalpell abkratzen. Behandeln Sie es mit Flussmittel und löten Sie es vor.
8. Überprüfen Sie mögliche Überschneidungen zwischen Elektroden mit einem Digitalmultimeter. Verbinden Sie die Steckerstifte mit dem Multimeter, das auf den Widerstandsmessmodus eingestellt werden muss. Paarweise Kombinationen von Kanälen prüfen; Ein Messwert auf dem Multimeter unter 5 MΩ deutet auf ein erhebliches Übersprechen hin.
9. Verwenden Sie ein Impedanzmessgerät, um die Impedanz jeder Drahtelektrode in Kochsalzlösung zu überprüfen. Typische Impedanzwerte liegen unter 100 kΩ.
10. Um die Implantation zu erleichtern, kleben Sie eine optische Faser so auf das Drahtarray, dass sich die Spitze der Faser auf der Höhe des kürzesten Drahtes befindet und die Faserspitze in unmittelbarer Nähe ist, aber die Wolframdrähte nicht berührt. Halten Sie den Winkel der Faser so klein wie möglich, um Gewebeschäden während der Implantation zu vermeiden.

>3. Stereotaktische Implantationen

1. Entfernen Sie das Bindegewebe von der Oberseite des Schädels und drücken Sie die Nackenmuskulatur gründlich um ca. 2 mm nach unten, um Muskelartefakte während der Aufnahme zu vermeiden.
2. Reinigen Sie den Schädel mit einem Watteapplikator und Kochsalzlösung und bohren Sie vier Löcher (2 vorne und zwei oberhalb des Kleinhirns, 0,8 mm Durchmesser), um Knochen-Edelstahlschrauben (00-96x1/16) für die Erdung und Stabilisierung des Implantats zu platzieren (Abbildung 1D). Positionieren Sie die Erdungsschraube, die mit einem Kupferdraht (ca. 2-3 cm lang) verbunden ist, über dem Kleinhirn.
3. Decken Sie die Schraube vollständig mit Zement ab, um Muskelartefakte während der elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu vermeiden. Bauen Sie einen Zementring, der alle Schrauben verbindet (Abbildung 1E).
4. Eine Kraniotomie oberhalb der Implantationsseite ist durchzuführen (Hippocampus, AP -1,94, L 1,4, V 1,4 bezogen auf das Bregma). Tragen Sie ca. 5 μl steriles NaCl auf die Oberfläche des Hirngewebes auf.
5. Senken Sie das Drahtarray langsam mit Stereotaxis in der Kraniotomie ab. Implantieren Sie für unitäre Aufzeichnungen eine Silikonsonde anstelle eines Drahtarrays. Um optoelektrische Lichtartefakte zu vermeiden, implantieren Sie die optische Faser separat in den Hippocampus, wobei die Faserspitze nicht direkt zur Sonde zeigt (Abbildung 1C-I). Zur Untersuchung der Koordination des Entrainments zwischen den Hemisphären wird eine zusätzliche optische Faser im kontralateralen hippokampalen CA1-Bereich implantiert.
6. Um das Hirngewebe zu schützen, tragen Sie ca. 5 μl warmes flüssiges Wachs/Paraffinöl, das auf 70 °C vorgewärmt wird, mit einer Spritze über der Implantationsstelle auf.
7. Tragen Sie Zement um das Drahtgitter auf und bedecken Sie den Schädel mit Zement.
8. Tragen Sie einen Tropfen Flussmittel auf den vorgelöteten Erdungs-/Referenzdraht und den vorgelöteten Draht auf, der z. B. mit einer Nadel mit der Erdungsschraube verbunden ist, und schmelzen Sie die Drähte mit einer Lötmaschine zusammen.
9. Decken Sie das gesamte Erdungskabel mit Zement ab.
10. Verabreichen Sie 0,3 ml Erycinum (1:4 in sterilem NaCl) und Carprofen (5 mg/ml) i.p. nach der Operation und mindestens für die zwei folgenden Tage. Die Maus wacht in der Regel innerhalb von 15 Minuten nach der Operation auf. Erwärmen Sie das Tier mit einer roten Lampe, um die Genesung zu beschleunigen.
11. Überwachen Sie das Gewicht der Maus täglich in der ersten Woche nach der Operation oder bis es stabil ist. Der Gewichtsverlust sollte 10 % des vor der Operation aufgezeichneten Gewichts der Maus nicht überschreiten. Um die Gewichtsstabilisierung zu beschleunigen, versorgen Sie die Maus in den ersten Tagen nach der Operation mit Nassfutter und Kondensmilch.
12. Um die zelluläre Aktivität des Hippocampus während des Entrainments aufzuzeichnen, implantierte eine Silikonsonde in den Hippocampus (AP -1,94, L 1,4, V 1, mit anschließender Absenkung) (Abbildung 1C-I). Die optische Faser wird in den Hippocampus bei AP -3, L 1.4, V 1.6, 39° kaudal-rostral implantiert. Wenn eine Stimulation der Zellsomata gewünscht ist, implantieren Sie im MS eine zusätzliche optische Faser (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° lateral).

Abbildung 1: Illustration von optischen Fasern, Elektroden und Chirurgie. (A) Illustration einer optischen Faser. (B) Illustration eines Drahtarrays, das auf eine optische Faser geklebt ist, um das Hippocampus-LFP während des Entrainments von hippokampalen Theta-Oszillationen aufzuzeichnen. (C) Zur Aufzeichnung der zellulären Aktivität des Hippocampus ist eine Silikonsonde auf einem Mikrolaufwerk montiert. (D) Miniaturschrauben werden am Schädel positioniert. Kupferdrähte werden an die Erdungs- und Referenzschrauben vorgelötet, bevor sie über dem Kleinhirn positioniert werden. (E) Zement wird aufgetragen, um die Schrauben abzudecken und zu verbinden. Der obere blaue Kreis zeigt an, wo die Kraniotomie für die Implantation der Silikonsonde durchgeführt wurde. Der untere blaue Kreis zeigt an, wo die Kraniotomie für die Implantation der optischen Faser im Hippocampus durchgeführt wurde. (F) Eine optische Faser wird in einem kaudal-rostralen Winkel implantiert, um auf die hippocampale CA1-Region abzuzielen. Eine zweite Faser kann in das mediale Septum implantiert werden, wenn eine Stimulation der Zellsomata gewünscht wird (optional). (G) Die Silikonsonde wird bis knapp über den Bereich des hippokampalen CA1 abgesenkt. (H) Die Ränder des Mikrolaufwerks und des Steckverbinders werden mit dem Implantat und der Masse verkittet, und die Referenzdrähte werden verlötet. (I) Das Kupfernetz ist so konstruiert, dass es das Implantat umgibt und als Faradayscher Käfig dient.