Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

Zusammenfassung

Quelle: Manseau, F., et al. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methods for Recording from the Isolated Nagetier Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Methode, die Optogenetik zu nutzen, um die Netzwerkdynamik des Hippocampus zu modulieren, indem genetisch veränderte lichtempfindliche Interneuronen in einem Maushirnschnitt aktiviert werden, die Synchronisation der Theta-Oszillation verbessert und das Verhalten neuronaler Schaltkreise untersucht wird.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

1. Optogenetische Kontrolle im isolierten Hippocampus
   HINWEIS: Für die optogenetische Kontrolle der Aktivität des hippokampalen Netzwerks wird hier eine zelltypspezifische Strategie verwendet, die die rhythmische Aktivierung von PV (Parvalbumin-positiv)-haltigen GABAergen Zellen beinhaltet, da gezeigt wurde, dass diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Synchronisierung der Hauptzellpopulationen im isolierten Hippocampus spielen. Die selektive Expression des exzitatorischen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) in PV-Zellen wird durch Kreuzung der PV-Cre-Mauslinie mit Mäusen erreicht, die konstitutiv ChR2 Cre-abhängig exprimieren (Ai32), wodurch PV-ChY-Mäuse erzeugt werden. Alternativ können virale Vektorkonstrukte (z.B. AAVdj-ChETA-eYFP) in den Hippocampus von PV-Cre- oder PV-TOM-Mäusen (P15-16) injiziert werden, um die Expression des exzitatorischen Opsins in CA1/SUB-Interneuronen zu steuern (Abbildung 1A).
   1. Platzieren Sie eine LFP-Elektrode im CA1/SUB-Bereich (Cornu ammonis-1/subiculum) und patchen Sie eine nahe gelegene Pyramidenzelle im isolierten Hippocampus einer Maus, die das blaulichtempfindliche exzitatorische Opsin ChR2 in PV-Interneuronen exprimiert.
   2. Platzieren Sie einen Lichtleiter aus optischen Fasern (0,2 - 1 mm Durchmesser) über der Hippocampuspräparation und zentrieren Sie ihn auf den aufgenommenen Bereich. Verwenden Sie blaues Licht (473 nm) von einer LED-Quelle für die optogenetische Stimulation, bestehend aus Lichtimpulsen (10 - 20 ms, ausgelöst durch ein Transistor-Transistor-Logiksignal) oder Sinuswellenspannungsbefehlen, die bei Theta-Frequenzen (4 - 12 Hz) abgegeben werden.
   3. Schalten Sie auf die Stromzange um und charakterisieren Sie die Aktivität des Pyramidenförmigen bei spontanen Theta-Oszillationen.
   4. Starten Sie das Stimulationsprotokoll und zeichnen Sie die Lichtreaktionen auf. Es ist zu beobachten, dass Feldoszillationen und synaptische Aktivität im aufgezeichneten Neuron während der optogenetischen Stimulation zunehmend synchronisiert werden und dass die rhythmische Stimulation von PV-Zellen zu einer robusten Kontrolle sowohl der Frequenz als auch der Leistung von Theta-Oszillationen führt (Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: Lokalfeldpotential- und simultane Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einzelnen CA1/SUB-Pyramiden- und PV-Neuronen während spontaner und optogenetisch gesteuerter Theta-Oszillationen im isolierten Hippocampus.

(a) Diagramm, das die Aufnahmestellen für LFP- und Patch-Elektroden zeigt, wobei die Platzierung des Lichtfaserleiters über dem CA1/SUB-B...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
reagenzien
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	Nr. S9625
Saccharose	Sigma Aldrich	Nr. S9378
Natriumbicarbonat	Sigma Aldrich	Nr. S5761
NaH2PO4 - monobasisches Natriumphosphat	Sigma Aldrich	Nr. S8282
Magnesiumsulfat	Sigma Aldrich	M7506
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	Nr. P3911
D-(+)-Glukose	Sigma Aldrich	Nr. G7528
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma Aldrich	Nr. C5080
Natriumascorbat	Sigma Aldrich	Nr. A7631-25G
Ausrüstung
95% O2/5% CO2-Gasgemisch (Carbogen)	Vitalär	SG466204A	Perfusionssystem
Glasflaschen/-flaschen (4 x 1 L)	n.a.	n.a.	Perfusionssystem
Untergetauchte Aufnahmekammer	Sonderanfertigung (FM)	n.a.	Kommerzielle Alternative kann verwendet werden
Multiclamp 700B Patch-Clamp-Verstärker	Molekulare Bauelemente	MULTICLAMP	Elektrophysiologie
Multiclamp 700B Commander Programm	Molekulare Bauelemente	MULTICLAMP	Elektrophysiologie
Digital/Analog-Wandler	Molekulare Bauelemente	DDI440	Elektrophysiologie
Mikromanipulatoren (manuell betätigt)	Siskiyou	MX130	Elektrophysiologie (LFP)
Mikromanipulatoren (automatisiert)	Siskiyou	MC1000e	Elektrophysiologie (Pflaster)
Audio-Monitor	A-M Systeme	Modell 3300	Elektrophysiologie
Speziell angefertigtes aufrechtes Fluoreszenzmikroskop	Siskiyou	n.a.	Bildgebung
Analoge Videokamera	COHU	Nr. 4912-2000/0000	Bildgebung
Digitaler Framegrabber mit Imaging-Software	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Bildgebung
Olympus 2,5x Objektiv	Olymp	MPLFLN	Bildgebung
Olympus 40x Wasser-Immersionsobjektiv	Olymp	UIS2 LUMPLFLN	Bildgebung
Maßgeschneidertes Leuchtdiodensystem (LED)	Gewohnheit	n.a.	optogenetische Stimulation (Amhilon et al., 2015)
Tiere
PV::Cre (KI) Mäuse	Jackson-Labor	Best.-Nr. 008069	Ermöglicht Cre-gerichtete Genexpression in PV-Interneuronen
Konstitutiv-bedingte Ai9-Mäuse (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Jackson-Labor	Best.-Nr. 007905	Exprimieren Sie TdTomato nach Cre-vermittelter Rekombination
Ai32-Mäuse (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Jackson-Labor	Lagernummer 012569	Exprimieren Sie das verbesserte Kanalrhodopsin-2/EYFP-Fusionsprotein nach Exposition gegenüber Cre-Rekombinase
PVChY-Mäuse	Inhouse-Zucht	n.a.	Nachkommen aus der Kreuzung der PV-Cre-Linie mit Ai32-Mäusen (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP