Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

1. Optogenetische Kontrolle im isolierten Hippocampus
   HINWEIS: Für die optogenetische Kontrolle der Aktivität des hippokampalen Netzwerks wird hier eine zelltypspezifische Strategie verwendet, die die rhythmische Aktivierung von PV (Parvalbumin-positiv)-haltigen GABAergen Zellen beinhaltet, da gezeigt wurde, dass diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Synchronisierung der Hauptzellpopulationen im isolierten Hippocampus spielen. Die selektive Expression des exzitatorischen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) in PV-Zellen wird durch Kreuzung der PV-Cre-Mauslinie mit Mäusen erreicht, die konstitutiv ChR2 Cre-abhängig exprimieren (Ai32), wodurch PV-ChY-Mäuse erzeugt werden. Alternativ können virale Vektorkonstrukte (z.B. AAVdj-ChETA-eYFP) in den Hippocampus von PV-Cre- oder PV-TOM-Mäusen (P15-16) injiziert werden, um die Expression des exzitatorischen Opsins in CA1/SUB-Interneuronen zu steuern (Abbildung 1A).
   1. Platzieren Sie eine LFP-Elektrode im CA1/SUB-Bereich (Cornu ammonis-1/subiculum) und patchen Sie eine nahe gelegene Pyramidenzelle im isolierten Hippocampus einer Maus, die das blaulichtempfindliche exzitatorische Opsin ChR2 in PV-Interneuronen exprimiert.
   2. Platzieren Sie einen Lichtleiter aus optischen Fasern (0,2 - 1 mm Durchmesser) über der Hippocampuspräparation und zentrieren Sie ihn auf den aufgenommenen Bereich. Verwenden Sie blaues Licht (473 nm) von einer LED-Quelle für die optogenetische Stimulation, bestehend aus Lichtimpulsen (10 - 20 ms, ausgelöst durch ein Transistor-Transistor-Logiksignal) oder Sinuswellenspannungsbefehlen, die bei Theta-Frequenzen (4 - 12 Hz) abgegeben werden.
   3. Schalten Sie auf die Stromzange um und charakterisieren Sie die Aktivität des Pyramidenförmigen bei spontanen Theta-Oszillationen.
   4. Starten Sie das Stimulationsprotokoll und zeichnen Sie die Lichtreaktionen auf. Es ist zu beobachten, dass Feldoszillationen und synaptische Aktivität im aufgezeichneten Neuron während der optogenetischen Stimulation zunehmend synchronisiert werden und dass die rhythmische Stimulation von PV-Zellen zu einer robusten Kontrolle sowohl der Frequenz als auch der Leistung von Theta-Oszillationen führt (Abbildung 1).

Abbildung 1: Lokalfeldpotential- und simultane Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einzelnen CA1/SUB-Pyramiden- und PV-Neuronen während spontaner und optogenetisch gesteuerter Theta-Oszillationen im isolierten Hippocampus.

(a) Diagramm, das die Aufnahmestellen für LFP- und Patch-Elektroden zeigt, wobei die Platzierung des Lichtfaserleiters über dem CA1/SUB-Bereich ein blaulichtempfindliches Opsin exprimiert (ChETA gekoppelt mit dem Fluorophor eYFP). (b) Charakterisierung eines pyramidalen Neurons mit typischen Regular-Spiking (RS) Eigenschaften (oben) und stark vergrößertem (40X) Bild der aufgenommenen Zelle (unten). (c) Beispiel-Stromzangenaufzeichnung derselben Zelle bei depolarisiertem Membranpotential (schwarz) zusammen mit dem LFP-Signal (grau) und mit synchronisierten rhythmischen IPSPs während spontaner Oszillation (links) und während Theta-Frequenz (6 Hz) Lichtstimulation (rechts). Das Muster der Lichtstimulation (blaue Schattierung) ist auf den Spannungskurven dargestellt. (d) Spektrogramm und Leistungsspektren der LFP-Wellenform vor, während und nach einer 6 Hz Lichtstimulation (Baseline, Stim, Post). (e) Hellfeld- und Fluoreszenzbilder mit geringer Vergrößerung des isolierten Hippocampuspräparats, die eine eYFP-Fluoreszenz (in grün) zeigen, die in der CA1/SUB-Region lokalisiert ist. (f) Charakterisierung der Stromschritte, die das Fast-Spiking (FS)-Verhalten eines aufgezeichneten PV-TOM-Interneurons zeigt (40-faches Fluoreszenzbild unten). (g) Membranpotentialaufzeichnung mit großen EPSPs und rhythmischem Feuern der aufgenommenen PV-Zelle, synchronisiert mit dem LFP-Signal während spontaner Feldoszillation (links) und während der Lichtstimulation (rechts) bei 3 Hz. (h) Field Triggered Average (FTA) von PV-Zellen-Spikes über dem CA1/SUB LFP-Signal. Die Entladung der PV-Zelle über mehrere Versuche (zentriert auf die LFP-Peaks) wurde in eine FTA von Spikes umgewandelt, die während der spontanen Oszillation (Baseline) und während der Lichtstimulation (Stim) aufgezeichnet wurden. Das mittlere und das untere Diagramm zeigen die Raster-Diagramme der Spitzen und die Histogramme der Spitzenwahrscheinlichkeit (die durchschnittliche Wahrscheinlichkeit wird in Rot dargestellt). Die obersten Diagramme zeigen Diagramme des durchschnittlichen LFP-Signals, dessen Leistung während der Lichtstimulation parallel zum hochsynchronisierten Zünden der PV-Zelle an Phase gekoppelt zum Höhepunkt der LFP-Oszillation zunahm.