Beurteilung einer funktionellen neuromuskulären Verbindung durch gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung

Zusammenfassung

Quelle: Liberman, M., et al., Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells der menschlichen neuromuskulären Verbindung. J. Vis. (2022).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Beurteilung funktioneller neuromuskulärer Verbindungen. Mit Hilfe eines Bioreaktors, der Muskelgewebe und Motoneuronen enthält, werden zusammen mit der Fluoreszenzmikroskopie die lichtempfindlichen Kanäle in den Neuronen stimuliert, um elektrische Signale zu erzeugen, was zu Muskelfaserkontraktionen führt.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Vorbereitung des Bioreaktors

1. Herstellung von Bioreaktorformen
   1. Laden Sie eine CAD-Datei (Computer-aided Design) für Bioreaktoren aus der ergänzenden CAD-Datei herunter oder erstellen Sie ein benutzerdefiniertes Design.
   2. Generieren Sie einen CNC-Werkzeugweg (Computer Numerical Control) aus dem 3D-Modell mit Hilfe der CAM-Software (Computer-Aided Manufacturing).
   3. Bearbeiten Sie Acetalformen mit einer CNC-Fräse.
2. Herstellung von Bioreaktoren
   1. Mischen Sie eine 10:1-Mischung aus Polydimethylsiloxan (PDMS, 77 g Mischung pro 4 Plattformen/Formen).
   2. Geben Sie das Gemisch in eine Vakuumkammer, schließen Sie alle Ventile, schalten Sie das Vakuum ein und entgasen Sie das Gemisch mindestens 30 Minuten lang, bis keine Luftblasen mehr übrig sind. Gießen Sie die Mischung in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 h.
   3. Verschließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Lege einen Sechskantstab aus Stahl über die Mitte und klemme ihn an beiden Seiten fest.
   4. Füllen Sie die Oberseite wieder mit PDMS auf.
   5. Die Förmchen im 65 °C heißen Backofen für mindestens 4 h aushärten.
   6. Entfernen Sie die Plattformen aus den Formen, nachdem Sie sie auf Raumtemperatur abgekühlt haben.
   7. Reinigen Sie die Geräte in einem Ultraschallbad mit 1-stündigen Spülmittelzyklen, 400 ml 100 % Isopropanol und destilliertem Wasser.
   8. Über Nacht bei 65 °C trocknen.
   9. Weichen Sie Glasdeckgläser 30 Minuten lang in 1 % nichtionischem Tensidpolyol ein und achten Sie darauf, dass sie sich nicht stapeln, damit sie alle richtig beschichtet sind.
   Mit
   10. destilliertem Wasser gut abspülen und über Nacht bei 65 °C trocknen lassen.
   11. Behandeln Sie die Glasdeckgläser und die PDMS-Plattform mit einem Plasmareiniger auf hoher Stufe mit 6 l/min Sauerstoff für 1-2 min. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 s lang auf das Deckglas drücken.
   12. Autoklavieren Sie die verklebten Geräte, bevor Sie Zellen hinzufügen.

>2. Aufbau eines optischen Stimulationsaufbaus

1. Befestigen Sie mit einem 30-mm-Käfigwürfelsystem einen dichroitischen Spiegel mit 573 nm in der Mitte. Koppeln Sie eine rote 627-nm-LED (Light Emitting Diode) mit einem 594-nm-Langpass-Anregungsfilter und befestigen Sie ihn an der Oberseite des Würfels, wobei die LED zum Spiegel zeigt. Befestigen Sie dann eine blaue 488-nm-LED mit einem 546-nm-Kurzpass-Anregungsfilter an der angrenzenden Seite des Würfels, wobei die LED zum Spiegel zeigt, wie im Schema in Abbildung 1A gezeigt.
2. Befestigen Sie eine ringbetätigte Irisblende an der Unterseite des Käfigwürfels, um die Größe des beleuchteten Bereichs zu steuern.
3. Versorgen Sie jede LED mit einem T-Cube LED-Treiber und steuern Sie sie über ein Arduino Uno Rev3-Board. Verbinden Sie den seitlichen Eingang des LED-Treibers mit einem Stromquellenstecker, verbinden Sie den mittleren Ausgang mit dem Arduino und verbinden Sie den seitlichen Ausgang direkt mit den LEDs.
4. Verbinden Sie den Arduino Uno mit einem USB-Kabel mit einem Computer.
5. Laden Sie Dateien über den GitHub-Link herunter (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Öffnen Sie die Datei "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" aus dem GitHub-Ordner.
7. Legen Sie die Startparameter fest: Schritte = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Stellen Sie sicher, dass der Pin-Ausgang 4 dem blauen LED-Treiber und der Pin-Ausgang 2 dem roten LED-Treiber zugewiesen ist. Überprüfen Sie, ob die mittleren Drähte des LED-Treibers mit der Masse und dem jeweiligen Pin-Ausgang verbunden sind.
9. Kompilieren Sie das Programm "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" und laden Sie es auf Arduino.
10. Schließen Sie jeden LED-Treiber an den entsprechenden Kanal an.

>3. Aufbau der Zellkultur (Tag -21-0)

1. Primäre Skelettmuskelzellen
   1. Tauen und expandieren Sie primäre Skelettmyoblasten (gewonnen aus Cook-Myosit) für maximal sechs Passagen mit myotonischem Wachstumsmedium (+ Ergänzung). Halten Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO₂ eingestellt ist.
   2. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
   3. Sobald die Zellen zu etwa 60 % konfluent sind, passieren Sie sie mit 0,05 % Trypsin-EDTA (1x, für 5 min bei 37 °C). Sammeln Sie die dissoziierten Zellen und fügen Sie frische Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
   4. Schleudern Sie die Zellen bei 300 x g herunter und aspirieren Sie den Überstand über dem Zellpellet.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen mit MGM und säen Sie 1:3 mit 60 mL pro Dreischichtkolben.
2. ChR2-hiPSC
   Anmerkung: Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet. In diesem Protokoll wurden ChR2-exprimierende hiPSCs mittels CRISPR-Cas9-Genomeditierung mit zuvor beschriebenen Methoden erzeugt18, aber alle stabilen optogenetischen Zelllinien (lentiviral, piggyBac usw.) können auf die gleiche Weise verwendet werden. Es wurden konstitutive Promotoren ausgewählt, die sowohl in iPSCs als auch in Motoneuronen exprimiert werden (CAG). Es wurde festgestellt, dass die Zellen gesunde Karyotypen aufweisen, wie in früheren Veröffentlichungen erwähnt.
   1. Beschichten Sie 6-Well-Platten mit 1 ml/Well solubilisierter Basalmembranmatrix, verdünnt in DMEM/F12 (1:80), und inkubieren Sie die Platten 1 h lang bei Raumtemperatur.
   2. IPS-Zellen auf beschichteten 6-Well-Platten mit 2 mL Feeder-freiem Zellkulturmedium (iPSC-Medien) säen, 2 mL Medium alle zwei Tage austauschen und alle 5-7 Tage übergeben. Halten Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO₂ eingestellt ist.
   3. Passieren
      1. Dissoziieren Sie die Stammzellen, indem Sie sie 4 Minuten lang mit 1 ml enzymfreiem Stammzellfreisetzungsreagenz inkubieren und mit einer P1000-Pipette mit breiter Spitze mechanisch scheren.
      2. Keimzellen im Verhältnis 1:24 oder 1:48 in iPSC-Medien mit 2 μM Y-27632 Dihydrochlorid in 2 ml/Vertiefung auf beschichtete 6-Well-Platten.

>4. Aussaat von Skelettmuskelgewebe (Tag -3)

1. Isolieren und zählen Sie 30 x 106 Myoblasten mit einem automatisierten Zellzähler.
2. Resuspendieren Sie die Myoblasten in einer 4:1-Mischung aus 3 mg/ml Kollagen I und solubilisierter Basalmembranmatrix (800 μl Kollagenmischung + 200 μl Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen). Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel hinzu (9:1 Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) und verdünnen Sie die Mischung mit 1x PBS, um ein Volumen von 800 μL zu erreichen.
3. Geben Sie 15 μl Zell-Kollagen-Suspension in jede Muskelkammer des Bioreaktors und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen (Abbildung 2).
4. Lassen Sie das Zell-Gel-Gemisch 30 min lang bei 37 °C polymerisieren und füllen Sie dann jede Bioreaktorvertiefung mit 450 μl myotonischem Wachstumsmedium.
5. Nach 3 Tagen (sobald das Gel verdichtet ist) beginnen Sie mit der Differenzierung der Myotuben.

>5. Differenzierung der Myotuben (Tage 0-14)

1. Beginnen Sie die Myotubeninfusion, indem Sie das Gewebe 7 Tage lang auf 450 μl fusionsinduzierende Medien (FS, Tabelle 1) umstellen und das Medium jeden zweiten Tag wechseln.
   Anmerkung: Versuchen Sie, die Differenzierung der Myotuben am selben Tag zu beginnen, an dem die Motoneuronen von den hiPSCs differenziert werden, um die Motoneurone am Ende der Differenzierungspläne beider Zelltypen zu säen.
2. An Tag 7 wird das Medium auf 450 μl Reifungsmedium Ia umgestellt (MMIa, Tabelle 1).
3. An Tag 9 auf 450 μl Reifungsmedium Ib umstellen (MMIb, Tabelle 1).
4. Wechseln Sie das Medium an Tag 11 auf 450 μl NbActiv4. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Motoneuronen ausgesät sind (Schritt 7).

>6. Differenzierung von Motoneuronen (Tage 0-14)

1. An Tag 0 werden 4 x 10⁶ ChR2-hiPSCs in eine Petrischale mit extrem niedrigem Attachment mit 15 ml Motoneuron-Suspensionskulturmedium (MSCM, Tabelle 1) überführt. Ergänzen Sie MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 5 μM Y-27632 Dihydrochlorid.
2. An Tag 2 isolieren Sie die Neurosphären (NS) mit einem reversiblen 37-μM-Sieb und geben Sie 15 ml MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 0,1 μM Retinsäure auf. Nach Tag 2 sollte der NS in der Petrischale sichtbar sein, ohne ein Mikroskop zu verwenden.
3. Übertragen Sie an Tag 4 die Zellen und Medien in ein 50-ml-Röhrchen und lassen Sie die Neurosphären am Boden absetzen (5 Minuten). Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 und 0,1 μM Retinsäure.
4. Wiederholen Sie an Tag 7 Schritt 6.3, resuspendieren Sie die Zellen jedoch in 15 ml MSCM, ergänzt mit 0,5 μM SAG und 0,1 μM Retinsäure.
5. Wiederholen Sie an Tag 9 Schritt 6.3, resuspendieren Sie jedoch die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 10 μM DAPT.
6. Wiederholen Sie an Tag 11 Schritt 6.3, resuspendieren Sie jedoch die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF.
7. Am 14. Tag säen Sie die Motoneuronen in die Plattform.

>7. Aussaat von Motoneuronenaggregaten im Bioreaktor (Tag 14)

1. Bereiten Sie eine 4:1-Gelmischung aus 2 mg/ml Kollagen I und Matrigel vor (800 μl Kollagenmischung + 200 μl Matrigel, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen). Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel hinzu (9:1 Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) und verdünnen Sie die Mischung mit 1x PBS, um ein Endvolumen von 800 μL zu erreichen.
2. Verwenden Sie ein 400-nm-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und sie in der Gelmischung zu resuspendieren.
3. Aspirieren Sie Medien aus dem Reservoir und vorsichtig aus der Neurosphärenvertiefung (Abbildung 2).
4. Geben Sie 15 μl der Gelmischung in den Neurosphärenkanal.
5. Laden Sie eine 10-μl-Pipette mit 10 μl Gel und wählen Sie dann eine Neurosphäre aus.
6. Legen Sie den NS in den Neurosphärenkanal und stellen Sie sicher, dass sich der NS in der Kammer befindet. Heben Sie die Pipette langsam an, während Sie das restliche Gel freisetzen, sobald das NS abgelagert ist. Wenn Sie sich nicht sicher sind, ob das NS korrekt abgelegt wurde, überprüfen Sie seine Position mit einem Mikroskop.
7. Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C polymerisieren.
8. Zu den Reservoirs werden 450 μl NbActiv4 hinzugefügt, ergänzt mit 20 ng/mL BDNF und 10 ng/mL GDNF.
9. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, um das axonale Wachstum von NS zum Muskelgewebe zu ermöglichen.

>8. Gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung der NMJ-Funktion (Tag 24+)

1. Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter (sCMOS)-Kamera.
2. Stellen Sie das Binning der Kamerasoftware auf 2x2, die Belichtung auf 20 ms, den Rolling-Shutter ein, die Ausleserate auf 540 MHz, den Dynamikbereich: 12 Bit und Verstärkung 1 und den Sensormodus: Überlappung.
3. Verwenden Sie ein 2-fach-Objektiv am Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden.
4. Befestigen Sie eine Lebendzellkammer (37 °C, 5 % CO₂) an dem Mikroskoptisch.
5. Wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren.
6. Platzieren Sie einen 594-nm-Langpass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem Bildgebungsobjektiv, um blaue Lichtimpulse von der Kamera herauszufiltern.
7. Setzen Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit 4 Bioreaktoren (24 Gewebe) in die Lebendzellkammer ein.
8. Klicken Sie auf Live View. Zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI.
9. Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) hoch, um die Bühnenposition, das Arduino-Board und die Videoaufnahme zu steuern.
10. Legen Sie den Ausgabefilm auf day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 fest.
11. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X,Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern/s.
12. Tauschen Sie das Medium nach der Bildgebung aus und geben Sie die Proben wieder in den Inkubator zurück. Zwischen den Bildaufnahmesitzungen sollten mindestens 24 Stunden liegen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Stimulation, Aufzeichnung und Analyse der NMJ-Funktion. (A) Schema des LED-Aufbaus und des Lichtwegs. (B) Optischer Aufbau mit einem inversen Mikroskop, einer Lebendzellkammer, einem automatisierten Tisch und einer sCMOS-Kamera. (C) Algorithmus für die Batch-Verarbeitung von optischen Stimulationsvideos von NMJ-Kulturen. (D

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellen
SkMDC (Englisch)	Koch-Myosit	Nr. 01059-14M
Medien und Beilagen
Erweitertes DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 12634-020
Rinderserum Albumin-Lösung	Millipore Sigma	Nr. A9576-50ML
G-5 Ergänzung (100X)	ThermoFisher Scientific	Nr. 17503-012
Geneticin selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	Tel.: 10131-035
Insulin, rekombinant human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Technologien für Stammzellen	Tel.: 100-0276
MyoTonic Medien-Kit für das Wachstum	Koch-Myosit	MK-4444
N-2 Ergänzung	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 17502-048
NBactiv4 500 mL	BrainBits GmbH	Sb4-500
Neurobasales Medium	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	Nr. A13710-01
Pluronische F-127	Sigma Aldrich	Nr. P2443
ReLeSR	Technologien für Stammzellen	5872
Kunststoffe
30 mm Käfigwürfelsystem	ThorLabs (Englisch)	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 und ER2-P4
37 μm Wendesieb, groß	Technologien für Stammzellen	Artikel-Nr.: 27250
546 nm Kurzpass-Anregungsfilter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroitischer Spiegel	Semrock	FF573-DI01–25x36
594 nm Langpass-Emissionsfilter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm Langpass-Anregungsfilter	Semrock	BLP01-594R-25
Blaue (470nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischen Sockel - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	Nr. SP-05-B4
Carclo 29,8° mattierte 10 mm kreisförmige Strahloptik - integrierte Beine	LuxeonStarLEDs	Nr. 10413
Corning 60 mm Kulturschale mit ultraniedrigem Aufsatz	Corning	3261
kühlkörper	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optik
pluriStrainer 400 μm, 25er Pack, steril	PluriSelect	Artikel-Nr.: 43-50400-03
pluriStrainer 500 μm, 25er Pack, steril	PluriSelect	Artikel-Nr.: 43-50500-03
Rote (627nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischen Sockel - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	Nr. TP-05-R5
ringbetätigte Irisblende	ThorLabs (Englisch)	SM1D12D
T-Cube LED-Treiber	ThorLabs (Englisch)	LEDD1B, KPS101
schimmelpilze
Sechskant-Abstandshalter mit Innengewinde, 3 1/2" 10-32, Teilgewinde 1/2"	Mcmaster	Artikel-Nr.: 91920A046
C-Klemme mit niedrigem Profil	Mcmaster	Nr. 1705A12
Wachstumsfaktoren
Adenosin 3′,5′-cyclisches Monophosphat	Millipore Sigma	Nr. A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	Nr. 4423-10
DAPT 10 mg	F&E-Systeme	Nr. 2634-10
Humanes CNTF, Forschungsqualität, 5 μg	Miltenyl Biotec	Tel.: 130-096-336
Humanes Vitronectin-Protein, CF	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 2349-VN-100
Humanes Vitronectin-Protein, CF	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 2349-VN-100
IGF1 Rekombinantes humanes Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin-Mausprotein, natürlich	ThermoFisher Scientific	23017015
Rekombinantes humanes Agrin-Protein	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 6624-AG-050
Rekombinantes humanes GDNF-Protein, CF 50ug	F&E-Systeme	212-GD-050/CF
Rekombinantes humanes Neurotrophin 3 100 μg	Zellwissenschaften	CRN500D
Rekombinantes humanes Neurotrophin-4	Zellwissenschaften	CRN501B
Rekombinanter menschlicher Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 1845-SH-100
Rekombinant Mensch/Maus/Ratte BDNF 50 ug	Peprotech	Nr. 450-02
Retinsäure, 50 mg	Millipore Sigma	Nr. R2625-50
SAG Geglätteter Agonist	Millipore Sigma	Artikel-Nr.: 566660
SB431542 10 mg	Technologien für Stammzellen	Artikel-Nr.: 72234
VorbauMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	Tel.: 130-103-925
Vitronectin aus menschlichem Plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 Dihydrochlorid	Tocris	Nr. 1254
Antikörper
α-Actinin mAb (Maus-IgG1)	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: ab9465
Cholin-Acetyltransferase (ChAT) (Ziege)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Maus IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin-Schwerkette (MHC) (Maus IgG2b)	DSHB	MF20
Ausrüstung
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automatisierte Bühne	Angewandte wissenschaftliche Instrumente	MS- 2000 XYZ
Expandierter Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automatisierter Zellzähler	Wissenschaftlicher Marschall	I-CACC
IX-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olymp	IX-ILL100LH
Serie Stage Top Inkubatorsystem	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Kamera	Andor-Technologie	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino-Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam für Solidworks
Matlab (Englisch)	Matlab (Englisch)	Nr. R2021b
NIS-Elemente	Nikon	Grundlagenforschung
Solidworks 3D-CAD	Solidworks (Englisch)	Solidworks Standard