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1. Vorbereitung der Zelllinie
- Tauen Sie etwa 1.000.000 Maus-Neuroblastom-Rückenmarkszellen (NSC-34-Zellen) auf, die in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff gelagert wurden. Verwenden Sie einen 37 °C heißen Wasserinkubator, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind.
- Fügen Sie frisches, warmes Medium hinzu (DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Pen-Streptokokken-Antibiotika).
- Zentrifugieren Sie aufgetaute Zellen (SL16R) bei 500 x g für 5 min und bilden Sie ein Zellpellet. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml neues Medium für die Zellresuspension hinzu.
- Die resuspendierten Zellen werden in einen 15-ml-Kolben gegeben und weitere 5 ml Medium hinzugefügt. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem sterilen Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C.
- Parallel dazu 8 unbeschichtete Deckgläser (Deckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dick) in eine 60-mm-Kulturschale legen und mit 70 % Ethanol und 30 min UV-Licht sterilisieren, bis es trocken ist. Geben Sie Medium in jedes Gericht und entsorgen Sie es, um das restliche Ethanol abzuwaschen.
- Geben Sie Trypsin-Puffer (2,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA in 1 l Hanks' Balanced Salt Solution) zu den Zellen, nachdem sie eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht haben (etwa 6 Millionen Zellen pro Kolben), damit adhärente Zellen dissoziieren können.
HINWEIS: NSC-34-Zellen sind empfindlich und benötigen nur 15 s Trypsinpuffer-Inkubation und 1 zusätzliche Minute trypsinfreie Inkubation, bevor sie mit dem Medium dissoziiert werden.
- Füllen Sie die Zellen auf die 60-mm-Kulturschalen, die bereits die Deckgläser enthalten, mit 3 ml Medium, ca. 350.000 pro Schale. Lassen Sie sie 24 Stunden im Inkubator, damit sich die Zellen auf den Deckgläsern anheften können.
2. Validierung der Proteinexpression
- 60-mm-Kulturschalen mit den (im obigen Versuch nicht verwendeten) Restzellen jeder Versuchsgruppe auf Eis legen.
- Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um das restliche Medium zu verdünnen und zu waschen.
- Behandeln Sie die Zellen mit 200-400 μl Lysepuffer mit PBS, 0,5 % Triton und Proteasehemmer-Cocktail-Tablette (PI). Kratzen Sie mit einem Zellschaber.
- Sammeln Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren Sie sie mit einem Homogenisator bei 4.000 U/min für 1 Minute unter Eis.
- Die homogenisierten Zellen werden 10 Minuten lang bei 2.500 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entnommen, die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay quantifiziert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
- Sammeln Sie zwischen 30 und 70 μg Gesamtprotein (je nach Protein) und laden Sie es in ein SDS-PAGE-Gel, um die Proteinexpression mit einem Immunoblot-Assay zu testen.