>1. Bestimmung der relativen Zelloberflächenproteinexpression in Astrozyten durch Biotinylierung
HINWEIS: Hier veranschaulichen wir die Anwendung dieser Biotinylierungstechnik zur Untersuchung der Auswirkungen des extrazellulären Matrixmoleküls Laminin auf die Zelloberflächenlokalisierung des wasserdurchlässigen Kanals Aquaporin-4 (AQP4). Zu den für diesen Assay erforderlichen Spezialmaterialien gehören Sulfo-NHS-LC-Biotin (Sulfosuccinimidyl-6-(Biotinamido)-Hexanoat) und Streptavidin-Agarose-Harz (siehe Materialtabelle).
- Mit der Methode werden Kulturen von kortikalen Astrozyten etwa 2 Wochen vor dem Assay vorbereitet und in 75 cmgroßen 2 belüfteten Kulturflaschen gezüchtet. Wenn Astrozyten zu 80 - 90 % konfluent sind, lösen Sie sie mit 0,05 % Trypsin von der Kulturoberfläche und passieren Sie sie dann 1:3.
- 48 Stunden vor dem Assay, wenn die Zellen wieder zu 80 - 90 % konfluent sind, werden die Astrozyten 1:3 (unter Berücksichtigung der Änderung des Kulturformats) auf 60-mm-Zellkulturschalen durchgeschleust, so dass sie am Tag des Experiments zu >70 % konfluent sind. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig auf die Schalen verteilt sind.
- 16 Stunden vor dem Assay wird Laminin in das Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 24 nM pipetiert und bei 37 °C inkubiert.
- Unmittelbar vor dem Assay Folgendes zubereiten und dann auf Eis legen oder kühl stellen: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O und 100 mg/L CaCl2 in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS], pH 7,4), Biotin-Puffer (0,5 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin in CM-PBS), Quenching-Puffer (50 mM NH4Cl in CM-PBS), Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], 1 % Triton X-100, 1x Proteasehemmer-Cocktail), 3x Ladepuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 30 % Glycerin, 300 mM Dithiothreitol [DTT] und 0,01 % Bromphenolblau) und Waschpuffer (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Proteasehemmer-Cocktail).
- Nehmen Sie die Schalen mit den Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium.
- Spülen Sie die Zellen dreimal mit 4 mL gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf Crushed Ice.
- Pipettieren Sie 2 ml Biotinpuffer in jede Vertiefung und kippen Sie die Gerichte einige Male vorsichtig hin und her, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. 30 Min. auf Eis ruhen lassen.
- Entfernen Sie den Biotinpuffer mit einem Aspirator und ersetzen Sie ihn durch einen 4-ml-Quenching-Puffer. 10 Min. auf Eis ruhen lassen.
- Der Quenchpuffer wird abgesaugt und durch ein entsprechendes Volumen desselben ersetzt. Auch hier 10 Minuten auf Eis ruhen lassen.
- Verwerfen Sie den Quenching-Puffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 mL gekühltem CM-PBS.
- Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber in 1 mL gekühltes CM-PBS und übertragen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl Lysepuffer wieder suspendieren.
- Lassen Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis, alle 5 Minuten vortexen, oder legen Sie sie auf einen durchgehenden Rotator bei 4 °C.
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C, um alle reinigungsmittelunlöslichen Materialien zu pelletieren. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Speichern Sie 50 μl dieses Lysats und fügen Sie ihm einen Ladepuffer hinzu. Dann denaturieren Sie es, indem Sie es in einem trockenen Bad auf 95 °C erhitzen; Dies ist die "Input"-Fraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine enthält.
- Erweitern Sie die Öffnung einer Pipettenspitze, indem Sie mit einer scharfen Schere etwa 0,5 cm Material von ihrem Ende abschneiden. Mit dieser Pipettenspitze werden 75 μl Streptavidin-Agarose-Kügelchen (die normalerweise bei 4 °C gelagert werden) in das Lysat überführt und 3 Stunden lang bei 4 ΰC auf dem Schüttler/Wippe inkubiert.
- Da Streptavidin-Agarose häufig als Aufschlämmung mit 50 Vol.-% Kügelchen verkauft wird, die in einer antimikrobiellen Lösung suspendiert sind, zerreiben Sie die Aufschlämmung, um sicherzustellen, dass die Kügelchen gleichmäßig suspendiert sind, und pipettieren Sie dann 150 μl der Suspension in jede Probe.
- Pellet Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1500 x g für 30 s bei 4 °C.
- Sparen Sie 50 μl des Überstands (fügen Sie Ladepuffer hinzu und denaturieren Sie ihn bei 95 °C in einem Wasserbad oder Heizblock); dies stellt die "intrazelluläre" Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen.
- Die pelletierten Kügelchen werden in 1 ml Waschpuffer resuspendiert und 3 min lang bei 4 °C geschüttelt. Pelletkügelchen (wie in Schritt 1.16) und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.
- Die Kügelchen durch Zentrifugation pelletieren (1500 x g für 30 s bei 4 °C) und den darüber liegenden Waschpuffer entsorgen. Geben Sie 50 μl 1X-Ladepuffer (verdünnt mit Lysepuffer). Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen freisetzen, indem diese bei 95 °C denaturiert werden; Diese Fraktion sollte nur biotinylierte Zelloberflächenproteine enthalten ("Zelloberflächen"-Fraktion).
- Trennung von Eingangs-, Zelloberflächen- und intrazellulären Fraktionen durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) und Analyse durch Western Blotting.
Anmerkung: Während wir in unseren Experimenten ein vorgefertigtes Gradientengel von 4 - 20 % verwendet haben, sollte ein 12 - 14 % Trenngel mit einer 4 % Stapelschicht (jeweils 0,1 % SDS) für die Proteine ausreichen, die in dieser Studie von Interesse sind. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Es ist zu beachten, dass es manchmal zu einer beobachtbaren Verschiebung der scheinbaren Molekülmassen biotinylierter Proteine kommen kann.