Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen in Astrozyten durch Biotinylierung
HINWEIS: Im Folgenden beschreiben wir ein typisches Pulsverfolgungs-Biotinylierungsexperiment, das in diesem Fall verwendet wird, um die Endozytose von AQP4 in Astrozyten zu verfolgen. Zu den erforderlichen Spezialmaterialien gehören Sulfo-NHS-SS-Biotin, Streptavidin-Agarose-Harz, reduziertes Glutathion und Jodacetamid (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie Kulturen von kortikalen Astrozyten der Maus in 60-mm-Schalen nach den im vorherigen Abschnitt beschriebenen Methoden vor. Stellen Sie sicher, dass die Zellen am Tag des Assays zu etwa 70 % konfluent sind und dass jede Schale eine entsprechende Anzahl von Zellen enthält.
- Unmittelbar vor dem Assay Folgendes vorbereiten und auf Eis legen oder kühl stellen: CM-PBS oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (100 mg/l MgCl2∙6H2O und 100 mg/l CaCl2 in 1X PBS, pH7,4), Biotinpuffer (0,5 mg/ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in CM-PBS), Reduktionspuffer (50 mM reduziertes Glutathion, 75 mM NaCl und 75 mM NaOH), Quenching-Puffer (50 mM Jodacetamid, 1 % BSA, in CM-PBS), Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM EDTA oder Ethylendiamintetraessigsäure, 1 % Triton X-100, 1x Proteaseinhibitor-Cocktail), 3x Ladepuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6 % SDS oder Natriumdodecylsulfat, 30 % Glycerin, 300 mM DTT oder Dithiothreitol und 0,01 % Bromphenolblau), und Waschpuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Proteaseinhibitor-Cocktail).
- Bereiten Sie frisches Zellkulturmedium vor (Dulbecco's Modified Eagle Medium oder DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin) und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad.
- Nehmen Sie Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium mit einem Aspirator.
- Spülen Sie die Zellen dreimal mit 4 mL gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerstoßenes Eis.
- Pipettieren Sie 3 ml Biotinpuffer in jede Schale, kippen Sie die Schalen einige Male hin und her, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist, und lassen Sie ihn 30 Minuten lang auf Eis stehen.
- Aspirieren Sie Biotinpuffer und ersetzen Sie ihn durch 5 mL warmes Medium. Eine Kulturschale wird 15 Minuten lang bei 37 °C und eine zweite Schale 30 Minuten lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Lassen Sie ein anderes Gericht bei 4 °C als 0-Minuten-Probe.
- Am Ende der Inkubationszeit wird das Medium verworfen und die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS gewaschen. Pipettieren Sie 6 mL Reduktionspuffer über die Zellen und lassen Sie sie 15 Minuten lang auf Eis.
- Entfernen Sie den Reduzierpuffer und ersetzen Sie ihn durch 6 mL frischen Reduzierpuffer. Die Mischung weitere 15 Minuten auf Eis legen.
- Entfernen Sie die Reduktionslösung und ersetzen Sie sie durch 6 mL Abschreckpuffer. 15 Min. auf Eis ruhen lassen.
- Wiederholen Sie den Abschreckschritt noch einmal.
- Quenching-Puffer verwerfen und die Zellen dreimal mit 4 mL gekühltem PBS waschen.
- Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber in 1 ml gekühltes PBS und überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 3 min. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl Lysepuffer resuspendieren.
- Lassen Sie diesen 30 Minuten auf Eis und wirbeln Sie ihn alle 5 min. Alternativ können Sie die Proben für diese Dauer auf einen durchgehenden Rotator bei 4 °C legen.
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die reinigungsmittelunlöslichen Materialien zu pelletieren, und überführen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie 50 μl dieses Lysats auf, fügen Sie ihm einen Ladepuffer hinzu und denaturieren Sie es bei 95 °C in einem trockenen Bad. Dies ist die "Input"-Fraktion, die sowohl biotinylierte endozytierte Proteine als auch nicht-biotinylierte Proteine enthält.
Mit - einer abgeschnittenen Pipettenspitze 150 μl der Streptavidin-Agarose-Aufschlämmung in das Lysat geben und 3 Stunden lang bei 4 °C auf einem Schüttler/einer Wippe inkubieren.
- Pellet Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 x g für 30 s bei 4 °C.
- Die Kügelchen werden in 1 mL Waschpuffer resuspendiert und 3 Minuten lang bei 4 °C gerockt. Kügelchen (gemäß Schritt 1.18) und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4 Mal, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.
- Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 x g für 30 s bei 4 °C und den darüber liegenden Waschpuffer entsorgen. 50 μL 1X Ladepuffer zugeben (mit Lysepuffer verdünnt). Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen durch Denaturierung bei 95 °C freisetzen; Diese Fraktion sollte nur internalisierte Proteine der Zelloberfläche enthalten ("endozytierte" Fraktion).
- Trennung von Eingangs-, Zelloberflächen- und ungebundenen Fraktionen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Analyse durch Western Blotting.
Anmerkung: Während wir in unseren Experimenten ein vorgefertigtes Gradientengel von 4 - 20 % verwendet haben, sollte ein 12 - 14 % Trenngel mit einer 4 % Stapelschicht (jeweils 0,1 % SDS) für die Proteine ausreichen, die in dieser Studie von Interesse sind. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Es ist zu beachten, dass es manchmal zu einer beobachtbaren Verschiebung der scheinbaren Molekülmassen biotinylierter Proteine kommen kann.
