Method Article

Bewertung der Internalisierung von Zieloberflächenproteinen mit Hilfe eines Biotin-Derivats

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Tham, D. K. L., et al., Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytären Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen mittels Biotinylierung. J. vis. exp. (2017).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Zielprotein-Internalisierung in den kortikalen Astrozyten der Maus mittels Biotinylierung, gefolgt von Zelllyse, Streptavidin-basierter Proteinextraktion, Denaturierung und Western-Blot-Analyse, um die erfolgreiche Internalisierung zu bestätigen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen in Astrozyten durch Biotinylierung

HINWEIS: Im Folgenden beschreiben wir ein typisches Pulsverfolgungs-Biotinylierungsexperiment, das in diesem Fall verwendet wird, um die Endozytose von AQP4 in Astrozyten zu verfolgen. Zu den erforderlichen Spezialmaterialien gehören Sulfo-NHS-SS-Biotin, Streptavidin-Agarose-Harz, reduziertes Glutathion und Jodacetamid (siehe Materialtabelle).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RinderserumalbuminSigma-AldrichNr. A9647-50
BromphenolblauBio-Rad#1610404
Kompletter Proteasehemmer-CocktailSigma-Aldrich11697498001
Dinatriumethylendiamintetraacetat-Dihydrat (EDTA)Bio-Rad#1610729
Dithiothreitol (DVB-T)Bio-Rad#1610611
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificTel.: 11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-BiotinThermo Fisher Scientific#21331
Fötales RinderserumGibco/Thermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 16000-044
GlycerinFisher ScientificNr. BP229-1
GlycinSigma-AldrichNr. G8898
JodacetamidBio-Rad#163-2109
L-GlutaminGibco/Thermo Fisher ScientificArtikel-Nr.: 25030-081
Penicillin/StreptomycinGibco/Thermo Fisher ScientificNr. 15140-122
Peroxidase AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch LaboratorienArtikel-Nr.: 111-035-045
Phosphatpuffer KochsalzlösungGibco/Thermo Fisher ScientificNr. 10010-023
Reduziertes GlutathionSigma-AldrichNr. G6529
Natriumchlorid (NaCl)Fisher ScientificNr. S271-500
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 862010
Natriumhydroxid (NaOH)Fisher ScientificNr. S318-100
Streptavidin AgaroseharzThermo Fisher Scientific#20347
Polyklonaler Kaninchen-Anti-AQP4-AntikörperAlomonNr. AQP-004
Tris-Basis (Trizma-Basis)Fisher ScientificNr. BP152-1
Tris-HClFisher ScientificNr. BP153-1
Triton X-100Fisher ScientificNr. BP151-500

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein InternalizationBiotinylation AssayCell Surface ProteinsStreptavidin PurificationWestern Blot AnalysisAstrocyte CulturesCleavable BiotinReducing Agent TreatmentStreptavidin AgaroseGel Electrophoresis

Related Articles