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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Matrizen
- 4-8 Silikonmatrizen in der Mikrowelle oder auf einer heißen Platte 5 min kochen und 1 h unter laminarer Strömung (mit der gestreiften Seite nach oben) vollständig trocknen lassen.
Anmerkung: Die folgenden Verfahren sollten unter laminarer Strömung durchgeführt werden.
- Blasen Sie Druckluft oder verwenden Sie transparentes Klebeband, um Staub von der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Halten Sie die gestreifte Seite sauber, damit sie fest auf der Plattenoberfläche haften kann.
- Legen Sie die Matrizen vorsichtig mit einem Finger auf 6 cm große Kunststoffschalen (eine Matrize pro Schale; mit der Streifenseite nach unten). Vermeiden Sie Luftblasen zwischen der Matrix und der Schüssel. Markieren Sie die Position der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale.
- Wenn sich die Matrix nicht anbringen lässt, wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 1.2.
>2. Streifenerzeugung und Lamininbeschichtung für die Neuronenkultur
- Bereiten Sie fluoreszenzmarkiertes rekombinantes Protein (je 25 μl für die Injektion [Schritt 2.2] oder je 100 μl für die Platzierungsmethode [Schritt 2.2.1]) vor, indem Sie das Fc-markierte Protein (10-50 μg/ml) und einen fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Anti-Fc-Antikörper (1 zu 3 Verhältnis: 30-150 μg/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mischen. Dann die Mischung 30 Minuten lang bei RT inkubieren.
- Mit einer 22-G-Spritze werden 25 μl des im vorigen Schritt (2.1) hergestellten rekombinanten Proteins durch das kleine Loch an der Seite der Matrix injiziert (Pfeile in Abbildung 1A, 1C und 1E).
- Alternativ können Sie 100 μl des rekombinanten Proteins in den oberen Schlitz der Matrix geben und etwa die Hälfte der Lösung aus dem kleinen Loch aspirieren (Pfeile in Abbildung 1A, 1C und 1E), so dass das rekombinante Protein in den gestreiften Bereichen verbleibt.
- Inkubieren Sie die Schale für 30 min bei 37 °C in einem Zellkultur-Inkubator.
- Geben Sie 300 μl PBS in den oberen Schlitz (Abbildung 1B) und aspirieren Sie aus dem kleinen Loch an der Seite der Matrix (Pfeile in Abbildung 1A, C und E), um nicht gebundene rekombinante Proteine zu entfernen. Aspirieren Sie das PBS nicht vollständig, da die Proteine sonst austrocknen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. (3 mal insgesamt)
- Entfernen Sie vorsichtig die Matrix und geben Sie sofort ~100 μl Kontrollprotein (10-50 μg/ml; Fc), um die gesamte gestreifte Fläche abzudecken, wodurch eine alternative Beschichtung entsteht. Inkubieren Sie die Schale dann 30 Minuten lang bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator.
- Nachdem Sie die Geschirroberfläche dreimal mit PBS gewaschen haben, bestreichen Sie sie mit ~100 μl 20 μg/ml Laminin in PBS.
Anmerkung: Laminin sollte auf Eis aufgetaut werden, um eine Verfestigung zu verhindern.
- Inkubieren Sie die Schale für 1 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator.
- Waschen Sie die Geschirroberfläche dreimal mit PBS und fügen Sie Nährmedium hinzu. Die beschichtete Schale mit Nährmedium wird bis zur Verwendung in einen 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C gestellt.
>3. Kultivierung von Hippocampus-Neuronen aus E15.5 Mausembryonen
- Euthanasieren Sie die Mutter durch Zervixluxation und isolieren Sie drei E15.5-Embryonen.
- Schneiden Sie die Haut und den Schädel sagittal an der Mittellinie des Kopfes mit einer Schere ein und entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Löffel. Übertragen Sie das Gehirn vorsichtig in eine 60-mm-Petrischale, die 3 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) enthält.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell die Hemisphären einschließlich Kortex, Hippocampus und Striatum aus (Abbildung 2A). Präparieren Sie dann die Hippocampusregion, indem Sie vorsichtig die Hirnhäute entfernen, und übertragen Sie das präparierte Hippocampusgewebe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 ml HBSS-Lösung auf Eis (Abbildung 2B-C). Sammeln Sie 6 Hippocampi von 3 Embryonen in der Röhre, die für die Kultivierung von Neuronen in 8 Schalen ausreichen.
- Die HBSS-Lösung wird durch Trypsin/Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin/EDTA)-Lösung (2 ml) ersetzt und das Röhrchen 15 min lang bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.
Anmerkung: HBSS ohne Zentrifugation aspirieren und die HBSS-Lösung nicht durch Kippen des Röhrchens dekantieren.
- Neutralisieren Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 500 μl fötalem Rinderserum (FBS).
- Die Mischung bei 100 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 2 ml Nährmedium waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Pipettieren Sie die Hippocampi 10 Mal in einem Nährmedium auf und ab, indem Sie eine 1.000-μl-Spitze mit einem großen Loch (Cut-Tip) verwenden, um das Gewebe zu dissoziieren.
- Wechseln Sie zu einer normalen (ungeschnittenen) 1.000-μl-Spitze und pipettieren Sie das dissoziierte Gewebe auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Trennen Sie die einzelnen Zellen, indem Sie sie durch ein 80-100-μm-Sieb leiten.
- Die filtrierte einzellige Suspension wird bei 150 x g 5 min lang zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand durch Aspirieren und resuspendieren Sie das Pellet (die Neuronen) in 2 ml Kulturmedium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung, um die Dichte und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Anschließend werden 10.000 Neuronen in 150 μl Kulturmedium für jeden Streifensatz plattiert. Die Suspension sollte vorsichtig platziert werden, um den gesamten Streifenbereich zu bedecken.
