Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Verabreichung einer wiederholten Induktion eines Schädel-Hirn-Traumas (TBI)
HINWEIS: Die TBI-Parameter wurden aus früheren Berichten angepasst, in denen die TBI-Auswirkungen einmal geliefert wurden. Das Protokoll wendet hier den gleichen Parameter an, mit dem Unterschied, dass die Gesamtzahl der Auswirkungen auf 10 erhöht wird.
- TBI-Ausrüstung
- Verwenden Sie ein speziell angefertigtes tragbares Gerät, um dem Mauskopf auf der rechten Seite ein geschlossenes Schädel-TBI (Abbildung 1A) zu verabreichen, wie in Abbildung 1B gezeigt.
- Vorbereitung vor der Operation
- Geräte für die Autoklavenchirurgie, einschließlich normaler Scheren, eines chirurgischen Messschiebers, einer chirurgischen Federschere, einer chirurgischen Zange, einer Mückenzange, Kopfpfostenstücke, Gaze und Applikatoren mit Wattespitze.
- Wiegen und notieren Sie das Körpergewicht der Maus 2 Stunden vor der Operation. Um Hirnödeme während der Schädelfensterimplantation zu minimieren, injizieren Sie Dexamethason-Natriumphosphat in einer Dosis von 4,8 mg/kg [2 mg/ml, normalerweise ~70 μl (muss an zwei Stellen injiziert werden)] mit einer Insulinspritze in den Quadrizepsmuskel. Nach der Injektion von Dexamethason, aber vor Beginn der SHT-Operation, bereiten Sie die Glasfenster wie in Schritt 2.1 gezeigt für die spätere Verwendung vor.
- Desinfizieren Sie das Operationsstadium und die SHT-Ausrüstung mit 75 % Ethanol. Erweitern Sie das sterile Einweg-OP-Tuch, um die Operationsphase auf der stereotaktischen Plattform abzudecken. Schalten Sie das Heizgerät und den Temperaturwächter ein und stellen Sie die Zieltemperatur auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie das Sauerstofftankventil und stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1,5 l/min ein. Öffnen Sie das Anästhesiegerät und stellen Sie den Isofluran-Wert auf drei,
HINWEIS: 100% reiner Sauerstoff kann dem Tier helfen, die Auswirkungen des SHT zu überleben.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und lassen Sie sie 5 Minuten lang stehen, um eine vollständige Anästhesie zu erreichen.
- Sobald die Maus vollständig anästhesiert ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen mit etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanz-Pinch-Reflexes), nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und platzieren Sie den Mauskopf in den stereotaktischen Rahmen.
- Platzieren Sie den Nasenkonus des Anästhesieschlauchs über der Schnauze der Maus.
- Halten Sie die Anästhesie mit 1,5 % Isofluran gemischt mit 100 % reinem Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l/min bis zum Ende der Operation aufrecht. Überprüfen Sie regelmäßig die Atemfrequenz und kneifen Sie während der Operation mindestens alle 15 Minuten in den Schwanz oder die Zehen, um eine geeignete Anästhesie zu beurteilen. Passen Sie die Isoflurankonzentration entsprechend an, um die gewünschte Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.
- SHT-Operation
- Verabreichen Sie Buprenorphin (1 mg/kg, subkutan) mit Einweg-Insulinspritzen und tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Maus auf.
- Entfernen Sie die Haare vom Scheitel des Kopfes, indem Sie sie mit einer Schere 1 kürzen und dann 1 Min. lang ein Enthaarungsmittel auftragen< />
ACHTUNG: Tragen Sie das Enthaarungsmittel nicht länger als 3 Minuten auf die Kopfhaut auf, da es hautreizend ist. Vermeiden Sie es auch, Enthaarungsmittel in die Augen der Maus zu bekommen.
- Reinigen Sie die Kopfhaut, indem Sie Gaze und Applikatoren mit Wattespitze auftragen. Desinfizieren Sie dann die Haut, indem Sie zuerst 75% Ethanol und dann Betadin verwenden. Wiederholen Sie dies dreimal (d. h. Ethanol gefolgt von Betadin) und belassen Sie die abschließende Anwendung von Betadin auf der Haut.
- Überprüfen Sie die Anästhesietiefe erneut, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig anästhesiert ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen mit etwa einem Zyklus alle 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzklemmreflexes). Zelten Sie die Haut mit einer chirurgischen Zange 3 und machen Sie einen 12-15 mm langen Schnitt in der Mittellinie, der etwa 3 mm hinter den Augen beginnt.
- Die Haut über der linken und rechten Hemisphäre des Schädels mit einer Federschere 2 herausschneiden.
- Sobald der Schädel freigelegt ist, entfernen Sie das Periost, indem Sie es vorsichtig mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze abreiben und mit steriler Kochsalzlösung spülen.
- Überprüfen Sie den Zustand des Schädels, um sicherzustellen, dass er intakt ist, mit Ausnahme der beiden kleinen Löcher, die für die vorherige Virusinjektion gemacht wurden.
- Trocknen Sie den Schädelbereich und markieren Sie die SHT-Aufprallstelle an den folgenden Koordinaten: 2,5 mm hinter dem Bregma und 2 mm lateral von der sagittalen Naht nach rechts (Abbildung 1B).
- Entfernen Sie die Maus schnell aus dem stereotaktischen Rahmen und platzieren Sie den Kopf auf dem Pufferkissen unter dem TBI-Gerät.
- Richten Sie die Schlagkörperspitze an der markierten Aufprallstelle aus.
- Heben Sie die Metallsäule an, indem Sie die angebundene Nylonschnur 15 cm über den Mauskopf ziehen und dann loslassen, sodass das Gewicht frei auf den Schallkopfstab fallen kann, der an der SHT-Stelle in Kontakt mit der Schädeldecke steht. Berühren Sie nicht den Mauskopf, wenn Sie den TBI-Aufprall ausführen.
- Bewegen Sie die Maus auf die Heizdecke und legen Sie sie auf den Rücken, während Sie den Atemstatus überwachen.
- Sobald sich die Maus von einer Rückenlage in eine Bauchlage aufrichtet, platzieren Sie sie für ~5 min in der Isofluran-Induktionskammer mit 3 % Isofluran, gemischt mit 100 % reinem Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1,5 l/min.
- Sobald die Maus vollständig sediert ist (d. h. langsame, aber gleichmäßige Atemfrequenzen von etwa einem Zyklus pro 2 s, gepaart mit dem Fehlen eines Schwanzklemmreflexes), wiederholen Sie die Schritte 1.3.9-1.3.14, um insgesamt 10 Stöße zu erzielen.
HINWEIS: In unserer Studie wurde festgestellt, dass zehn TBI-Auswirkungen einen robusten Phänotyp mit geringer Mausmortalität induzieren (Daten noch nicht veröffentlicht). Die Parameter können angepasst werden, um eine unterschiedliche Schwere der Hirnverletzung zu erreichen, indem die Anzahl der Stöße und/oder die Höhe, aus der das Gewicht gelöst wird, erhöht oder verringert wird. Alle Parameter unterliegen der Genehmigung durch die lokale IACUC.
- Untersuchen Sie den Schädel unter einem Operationsmikroskop und entfernen Sie die Maus aus der Studie, wenn eine Schädelfraktur aufgetreten ist.
- Befolgen Sie bei der Scheinoperation die gleichen Verfahren wie oben beschrieben, einschließlich des Platzierens des Tieres unter dem Impaktor, ohne jedoch die SHT-Auswirkungen zu verabreichen.
- Nachdem sich die Maus nach dem 10. TBI-Aufprall von einer Rückenlage in eine Bauchlage aufgerichtet hat, legen Sie sie für ~5 Minuten in die Isofluran-Induktionskammer. Befolgen Sie dann die Schritte 1.2.6-1.2.8, um den Mauskopf auf den stereotaktischen Rahmen für die unten beschriebene Schädelfensterimplantation zu setzen.
