Methodenartikel

Fluoreszenz-Immunfärbung von Hippocampus-Neuronen der Ratte in einem mikrofluidischen Chip

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Nagendran, T., et al., Verwendung von vormontierten mikrofluidischen Kunststoffchips zur Kompartimentierung primärer muriner Neuronen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Hippocampus-Neuronen von Ratten, die in einem mikrofluidischen Chip kultiviert wurden, um die neuronale Reifung und Konnektivität zu analysieren.

Protokoll

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1. Fluoreszenz-Immunfärbung innerhalb des Chips

  1. Herstellung einer 4%igen Formaldehyd-Fixierlösung in PBS (4% Formaldehyd, 1 μM MgCl2, 0,1 μm CaCl2, 120 mM Saccharose)
  2. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums aus den Vertiefungen des Chips (trocknen Sie die Innenfächer nicht).
  3. Geben Sie sofort 100 μl Fixierlösung in die oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente.
  4. Geben Sie nach 1 Minute 100 μl Fixierlösung in die unteren Vertiefungen. 30 min bei Raumtemperatur fixieren.
  5. Entfernen Sie den größten Teil der Lösung aus den Vertiefungen des Chips (trocknen Sie die Innenfächer nicht). Geben Sie sofort 150 μl PBS in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente. Warten Sie 2 Minuten, bis das PBS in die unteren Vertiefungen fließt.
  6. Wiederholen Sie Schritt 1.5 zweimal.
  7. Entfernen Sie den größten Teil des PBS aus den Vertiefungen des Chips. Geben Sie sofort 150 μl PBS mit 0,25 % TritonX-100 in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente. Warten Sie 15 Minuten.
  8. Entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Chips und geben Sie sofort 150 μl Blockierungslösung (10 % normales Ziegenserum in PBS) in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente. Warten Sie 15 Min.
    Anmerkung: Wirksame Blockierungslösungen sollten spezifisch für den Sekundärantikörper sein, z. B. für einen Esel-Anti-Schaf-Sekundärantikörper Eselsserum in der Blockierungslösung verwenden.
  9. Entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Chips und geben Sie sofort 100 μl Primärantikörper (oder Antikörper) in 1 % normalem Ziegenserum in PBS in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente. Abdecken, um die Verdunstung zu minimieren, und 1 h bei Raumtemperatur oder 4 °C über Nacht warten.
  10. Entfernen Sie den größten Teil der Lösung aus den Vertiefungen des Chips (trocknen Sie die Innenfächer nicht). Geben Sie sofort 150 μl PBS in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente. Warten Sie 5 Minuten, bis das PBS in die unteren Vertiefungen fließt.
  11. Wiederholen Sie Schritt 1.10 zweimal.
  12. Entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Chips und fügen Sie sofort 100 μl Sekundärantikörper (oder Antikörper) in PBS in jede der oberen Vertiefungen der axonalen und somatischen Kompartimente hinzu. Abdecken, um die Verdunstung zu minimieren, und 1 h bei Raumtemperatur warten.
    Anmerkung: Die empfohlene Verdünnung von Sekundärantikörpern entnehmen Sie bitte den Anweisungen des Herstellers.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.11.
  14. Wenn die Bildgebung innerhalb von 1 Tag nach der Immunfärbung durchgeführt wird, halten Sie den Chip mit PBS gefüllt. Wenn der Chip länger als 1 Tag vor der Bildgebung gelagert wird, wickeln Sie die Schale mit dem Chip in Paraffinfolie ein, um eine Verdunstung zu verhindern, und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
  15. Für die längerfristige Lagerung von Proben können Einbettmedien (z. B. Fluoromount-G) verwendet werden.
    1. Entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus den Vertiefungen des Chips. Verwenden Sie eine 1-ml-Einwegpipette aus Kunststoff, um jeweils 2 Tropfen Eindeckmedium in die oberen Vertiefungen des axonalen und somatischen Kompartiments zu geben.
    2. Kippen Sie den Chip, um den Durchfluss des Einbettmediums durch die Kanäle zu fördern. Nach 5 Minuten 2 Tropfen in die unteren Vertiefungen geben. Warten Sie 1 Stunde vor der Bildgebung.
      Anmerkung: Nach der Verwendung von Einhängemedien ist es nicht möglich, erneut nach anderen Zielen zu suchen.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
XonaChip (Englisch)Xona Mikrofluidik, LLCXC150150 μm lange Mikrorillenbarriere
XonaChip (Englisch)Xona Mikrofluidik, LLCXC450450 μm lange Mikrorillenbarriere
XonaChip (Englisch)Xona Mikrofluidik, LLCXC900900 μm lange Mikrorillenbarriere
XC-AnstrichXona Mikrofluidik, LLCXC Vorbeschichtungim Lieferumfang von XonaChips enthalten
XonaPDLXona Mikrofluidik, LLCXonaPDL
Neurobasales MediumThermoFisher Scientific21103049
Glaspasteur-PipettenSigma-AldrichCLS7095D5X SIGMA
Durchstechen Sie 16% FormaldehydThermoFisher ScientificArtikel-Nr.: 28906
PBS (10-fach)ThermoFisher ScientificQVC0508
Normales ZiegenserumThermoFisher Scientific16210064
Triton X-100ThermoFisher ScientificArtikel-Nr.: 28314
Anti-vGlut1-AntikörperNeuroMabNr. 75-066Klon N28/9, 1:100
Alexa Fluor SekundärantikörperThermoFisher Scientific17:40 Uhr
Konfokales Bildgebungssystem mit Spinning-DiskAndor-TechnologieCSU-X1, iXon X3 EMCCD60x Silikonöl & 20x Objektive

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Schlagwörter

Konfokalmikroskopiesynaptische Markerprim re Antik rpersekund re Antik rperTriton X 100PBS WaschschritteBlockierungsl sung

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