Quantifizierung von filamentösem Aktin puncta in kortikalen Neuronen der Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Li, H., et al. Quantifizierung von filamentösem Aktin (F-Aktin) Puncta in kortikalen Neuronen von Ratten. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur fluoreszierenden Färbung von kortikalen Neuronen von Ratten für die Mikroskopie. Es zielt auf F-Aktin und dendritische Proteine ab, um die strukturelle Integrität zu analysieren und die F-Aktin-Dichte zu berechnen, die für die Untersuchung der neuronalen Funktion und Gesundheit entscheidend ist.

Protokoll

1. Fluoreszenzmarkierung und Immunzytochemie

Hinweis: Die Immunfluoreszenzmarkierung von primären kortikalen Zellkulturen wurde in 35-mm-Zellkulturschalen mit Glasboden und einem Arbeitsvolumen von 1 ml durchgeführt.

1. Waschen Sie die Glasbodenschale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS).
2. Fixieren Sie die Zellen 15 min lang mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT).
3. Die Zellen zweimal mit PBS waschen und mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisieren.
4. Behandeln Sie die Zellen 20 Minuten lang bei RT mit einem F(filamentös)-aktin-spezifischen Farbstoff, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 μl Phalloidin in 1 ml PBS).
5. Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und blockieren Sie sie 1-2 Stunden lang mit 10 % normalem Ziegenserum bei RT.
6. Verdünnen Sie den polyklonalen Anti-MAP2-Antikörper (Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2) (1:2.500) in PBS mit 2 % normalem Ziegenserum und inkubieren Sie O/N (über Nacht) bei 4 ⁰°C.
7. Spülen Sie nach der Inkubation zweimal in PBS.
8. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper (Alexa Red 594-konjugiertes Ziegen-Anti-Hühner-IgG (1:500) mit 2 % normalem Ziegenserum und inkubieren Sie es 2 Stunden lang bei RT.
9. Mit PBS spülen und 10 μl/Schale Hoescht Farbstoff hinzufügen.
10. 3 min bei RT inkubieren und zweimal mit PBS waschen.
    Anmerkung: Die markierten Zellen sind nun bereit für Schritt 2 (F-Aktin-Puncta-Zählung).
11. Bewahren Sie die Zellprobe mit 100 μl Antifading-Reagenz als Deckmittel auf und bewahren Sie sie für die Langzeitlagerung bei 4 ⁰C im Dunkeln auf.
    Anmerkung: Phalloidin ist in PBS bei +4 °C im Dunkeln bis zu 1 Woche lang relativ stabil, und die Fluoreszenz kann mit Antifading-Deckreagenzien erhalten werden. Optimale Bilder werden jedoch 1-3 Tage nach der Färbung erhalten, da Phalloidin bei längerer Lagerung beginnen kann, nach außen zu diffundieren.

>2. F-Aktin-Puncta-Zählung

1. Schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein und wechseln Sie zum 20×Objektiv. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware und richten Sie das Programm mit einer Bildgröße von 1280×960 Pixeln und einer Bildauflösung von 0,17 μm/Pixel bei einem Zoom von 1× ein.
2. Erfassen Sie Bilder von co-markierten F-Aktin/MAP2-Neuronen unter grünen (495 nm) oder roten (613 nm) Fluoreszenzkanälen.
3. Wählen Sie 5 grün (F-Aktin)/rot (MAP2) immunmarkierte/blaue (Hoescht) Fluoreszenzbilder einzelner Neuronen mit klar definierten dendritischen Dornen.
4. Identifizieren Sie die F-Aktin-reichen Strukturen im dendritischen Segment zweiter Ordnung (Längenbereich 25-75 μm) mit kontinuierlicher MAP2-Immunfluoreszenz.
5. Drehen Sie den ausgewählten Bildbereich auf eine horizontale Ebene. Kopieren und Einfügen als neues Bild.
6. Subtrahieren Sie den Hintergrund von Bildern, indem Sie für jedes Gericht eine konsistente Anpassung vornehmen.
7. Zählen Sie die hellgrünen F-Aktin-Puncta und verfolgen Sie die Länge des ausgewählten dendritischen Segments manuell mit geschulten unabhängigen Beobachtern. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei.
8. Berechnen Sie die Dichte, indem Sie die gesamten F-Aktin-markierten Punktzahlen (N) durch die Länge (L) der MAP2-markierten Dendriten dividieren. Express-Daten als Anzahl der F-Aktin-Puncta pro 10 μm Dendriten
   Anmerkung: In jedem ausgewählten dendritischen Segment wurden Puncta (Größe ≤1,5 μm) von F-Aktin-Fluoreszenz mit einer Spitzenintensität von mindestens 50% über der durchschnittlichen Färbeintensität im dendritischen Schacht eingeschlossen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Glasbodenschalen Nr. 1,5 Deckglas	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mittel	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 10565-018
Poly-L-Lysin	Sigma	Nr. P9155
Paraformaldehyd	Sigma	Nr. P6148
AlexaFluor 488 Phalloidin	Lebenstechnologien	Nr. A12379
Normales Pferdeserum	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 26050-070
Polyklonales Anti-MAP2 von Hühnerfleisch	ABCAM	Artikel-Nr.: AB92434
Alexa Red 594-konjugiertes Ziegen-Anti-Hühner-IgG	Lebenstechnologien	Nr. A11042
NucBlue Lebendzellfärbung ReadyProbes Reagenz Hoescht 33342	Lebenstechnologien	Nr. R37605
Softwarepaket NIS-Elements	Nikon Instrumente
Nikon Eclipse TE2000-E inverses fluoreszierendes computergesteuertes Mikroskop	Nikon Instrumente