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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tiere
- Verwenden Sie in dieser Studie männliche und weibliche Ratten im Alter von 3 Monaten.
- Halten Sie die Tiere in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
>2. Zubereitung des KAX (Ketamin + Xylazin + Acepromazin) Cocktails für die Tieranästhesie
- 50 mg Xylazin (20 mg/ml) in 5 ml Ketamin (100 mg/ml) mit 1 ml Acepromazin (10 mg/ml) und 3 ml destilliertem Wasser auflösen. Gründlich mischen.
- Sterilisieren Sie diese Lösung mit einem Spritzenvorsatzfilter und bewahren Sie sie in einer 10-ml-Serumflasche auf.
>3. KAX-Injektion
- Das Tier (g) wird gewogen und bis zur Injektion in den Käfig zurückgebracht.
- 0,1 ml KAX/100 g Körpergewicht des Tieres intraperitoneal mit einer 1 ml Insulinspritze und einer 28 g Nadel injizieren.
- Lassen Sie das Tier bewusstlos werden. Überprüfen Sie die Reflexe, indem Sie die Füße und den Schwanz kneifen.
- Bewahren Sie alle Tiere für die Dauer der Operation sicher im Labor auf.
- Setzen Sie die Tiere nach der Operation in ihre Käfige zurück und halten Sie sie bei Raumtemperatur (RT) bequem, bis Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben. Bringen Sie die Tiere nur dann in die Tiereinrichtung zurück, wenn die Tiere erwachen und ihr normales Verhalten wieder aufnehmen.
>4. Vorbereitung auf die Operation und Mikronadelmontage
- Stellen Sie eine sterile 2 M NaCl-Lösung her.
- Ziehen Sie mit einem Mikroelektrodenabzieher (Abbildung 1C) ein schweres, poliertes und dünnwandiges Borosilikatrohr mit einem Innendurchmesser von 0,86 mm in zwei fein verjüngte Glasmikronadeln (Abbildung 1D, Abbildung 1E).
- Füllen Sie eine Mikronadel aus dem vorherigen Schritt mit 2 M Kochsalzlösung unter Verwendung einer Rückfüllspritzennadel und einer 1-ml-Spritze auf (Abbildung 1B). Klopfen Sie Luftblasen aus der Spitze der Elektrode aus.
- Füllen Sie eine zweite 1 ml Spritze mit 2 M NaCl. Schließen Sie eine 18-G-Nadel an und befestigen Sie dann einen Polyethylenschlauch von einem Durchmesser (ca. 10 Zoll) (Abbildung 1A). Verwenden Sie den Spritzenkolben, um den Polyethylenschlauch durch die Nadel mit Kochsalzlösung zu füllen.
- Wenn sowohl die Mikronadel als auch der Schlauch mit Kochsalzlösung gefüllt sind, verbinden Sie die beiden vorsichtig. Entfernen Sie jegliche Luft in der Verbindung zwischen ihnen (Abbildung 2).
- Schrägen Sie die Spitze der Mikronadel fein ab, indem Sie sie ganz leicht gegen die Faser eines groben Papiertuchs kratzen.
- Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadel, indem Sie den Kolben vorsichtig auf die Spritze drücken, bis ein feiner Flüssigkeitsstrahl auf dem Papiertuch zu sehen ist. Der Flüssigkeitsstrahl sollte nicht breiter als 0,5 mm sein.
>5. Vorbereitung des Tieres
- Tragen Sie 1 - 2 Tropfen topisches Anästhetikum auf die Hornhaut auf (Proparacainhydrochlorid Ophthalmic Solution, USP, 0,5%). Warten Sie, bis kein Augenreflex mehr auftritt.
- Schneiden Sie die Schnurrhaare mit einer Schere.
- Tränken Sie einen Wattestäbchen-Applikator mit Betadinlösung und tupfen Sie den Bereich um das experimentelle Auge ab.
- Befestigen Sie mit einem Mikroskop ein Hämostatikum, um das untere Augenlid zu klemmen, um das Auge zu wölben, die Episklervene freizulegen und die Augenbewegung einzuschränken. (Abbildung 3, Pfeilspitze)
>6. Glaukom-induzierende Kochsalzlösung Injektion
- Wenn die Mikronadel und das Tier vorbereitet sind, beginnen Sie mit den Injektionen.
- Wenn bestätigt wird, dass das Tier nicht auf das Einklemmen der Füße/des Schwanzes reagiert, stechen Sie vorsichtig mit der Mikronadel in die Episklerallervene, indem Sie in einem niedrigen Winkel zwischen 10 und 20 Grad zur Vene kommen (Abbildung 3, weißer Pfeil). Eine erfolgreiche Punktion in die Vene zeigt sich, wenn Blut in die Spitze der Mikronadel eindringt (Abbildung 3, schwarzer Pfeil).
- Injizieren Sie langsam und manuell ca. 50 μl Kochsalzlösung in die Vene. Dies sollte ca. 10 Sekunden dauern. Die Venen werden weiß, wenn das Salz durch das Gefäßsystem zirkuliert (Abbildung 4, Pfeilspitze). Einige Regionen können ein blutrotes Aussehen beibehalten (Abbildung 4, Pfeil).
- Führen Sie eine zweite Injektion in die Vene durch, die der Stelle der ersten gegenüberliegt, um eine gründliche Schädigung der gesamten retinalen Ganglienzellschicht zu gewährleisten.
Hinweis: Innerhalb von Minuten sollte man ein deutliches trübes Aussehen durch die Iris des Auges sehen, wenn das Salz durch das Gefäßsystem zirkuliert.
- Lassen Sie das gegenüberliegende Auge unbehandelt, um es als interne Kontrolle zu verwenden.
